هدف، ویژگی ها و استفاده از میکروسکوپ فلورسانس
اصل و ویژگی های ساختاری میکروسکوپ فلورسانس: میکروسکوپ فلورسانس از یک منبع نور نقطه ای با بازده نوری بالا استفاده می کند تا طول موج خاصی از نور (مانند نور فرابنفش 3650 اینچ یا نور آبی بنفش 4200 اینچ) را از طریق سیستم فیلتر به عنوان تحریک ساطع کند. نور برای تحریک فلورسانس در نمونه. پس از اینکه ماده فلورسانس رنگ های مختلف را منتشر می کند، از طریق بزرگنمایی عدسی شیئی و چشمی مشاهده می شود. به این ترتیب، تحت یک پسزمینه کنتراست قوی، حتی اگر فلورسانس بسیار ضعیف باشد، به راحتی قابل تشخیص است و از حساسیت بالایی برخوردار است. این عمدتا برای تحقیقات ساختار سلولی و عملکرد و ترکیب شیمیایی استفاده می شود. ساختار اصلی یک میکروسکوپ فلورسانس از یک میکروسکوپ نوری معمولی به همراه برخی لوازم جانبی (مانند منبع نور فلورسنت، فیلتر تحریک، تقسیم کننده پرتو دو رنگ و فیلتر مسدود کننده و غیره) تشکیل شده است. منبع نور فلورسنت - معمولاً از لامپ جیوه ای با فشار فوق العاده (50-200 W) استفاده می شود که می تواند نور با طول موج های مختلف ساطع کند، اما هر ماده فلورسنت دارای طول موج تحریکی است که قوی ترین فلورسانس را تولید می کند، بنابراین یک فیلتر تحریک (به طور کلی، فیلترهای تحریک ماوراء بنفش، بنفش، آبی و سبز وجود دارد که تنها به نور تحریکی با طول موج مشخص اجازه عبور داده و تابش نمونه را می دهد، در حالی که نور دیگر را جذب می کند. پس از تابش هر ماده توسط نور تحریک، فلورسانس مرئی با طول موج بیشتر از طول موج تابش در مدت زمان بسیار کوتاهی ساطع می کند. فلورسانس خاص و به طور کلی ضعیف تر از نور تحریک است. به منظور مشاهده فلورسانس خاص، یک فیلتر مسدود کننده (یا سرکوب کننده) در پشت عدسی شیئی مورد نیاز است.
دو عملکرد دارد: یکی جذب و جلوگیری از ورود نور تحریک کننده به چشمی، به طوری که فلورسانس را مختل نکرده و به چشم آسیب نرساند. دیگری این است که انتخاب کنید و اجازه دهید فلورسانس خاص از آن عبور کند و یک رنگ فلورسنت خاص را نشان دهد. این دو فیلتر باید با هم استفاده شوند.
دو نوع میکروسکوپ فلورسانس از نظر مسیرهای نوری آنها وجود دارد:
1. میکروسکوپ فلورسانس انتقال: منبع نور تحریک از طریق ماده نمونه از طریق یک لنز کندانسور عبور داده می شود تا فلورسانس را تحریک کند. معمولاً از یک کلکتور میدان تاریک استفاده می شود و یک کلکتور معمولی نیز می تواند برای تنظیم آینه استفاده شود تا نور تحریک به سمت نمونه هدایت شود و دور بزند. این یک میکروسکوپ فلورسنت قدیمی است. مزیت این است که فلورسانس در بزرگنمایی کم قوی است، اما عیب آن این است که با افزایش بزرگنمایی، فلورسانس کاهش می یابد. بنابراین بهتر است مواد نمونه بزرگتر را مشاهده کنید.
2. میکروسکوپ اپی فلورسانس نوع جدیدی از میکروسکوپ فلورسانس است که در دوران مدرن توسعه یافته است. تفاوت این است که نور تحریک از عدسی شیئی به سطح نمونه می افتد، یعنی همان عدسی شیئی به عنوان کندانسور روشنایی و عدسی شیئی برای جمع آوری فلورسانس استفاده می شود. در مسیر نور، که 45 درجه از اورانیوم سبک فاصله دارد، باید یک تقسیم کننده پرتو دو رنگی اضافه شود. نور تحریک به عدسی شیئی منعکس شده و روی نمونه جمع آوری می شود. فلورسانس تولید شده توسط نمونه و نور تحریک منعکس شده توسط سطح عدسی عدسی شیئی و سطح شیشه پوششی به طور همزمان وارد عدسی شیئی می شوند و به جداکننده پرتو دو رنگ برمی گردند تا نور تحریک از فلورسانس جدا شود. نور تحریک باقیمانده توسط فیلترهای مسدود کننده جذب می شود. مانند تغییر به ترکیبی از فیلترهای مختلف تحریک / تقسیم کننده پرتو دو رنگ / فیلتر مسدود کننده، می تواند نیازهای محصولات مختلف واکنش فلورسنت را برآورده کند. مزیت این نوع میکروسکوپ فلورسانس این است که نور میدان دید یکنواخت است، تصویربرداری واضح است و هر چه بزرگنمایی بیشتر باشد، فلورسانس قوی تر است.
(2) نحوه استفاده از میکروسکوپ فلورسانس.
1. منبع نور را روشن کنید و لامپ جیوه ای با فشار فوق العاده بالا باید چند دقیقه گرم شود تا به روشن ترین نقطه برسد.
2. میکروسکوپ فلورسانس انتقال باید فیلتر تحریک مورد نیاز را بین منبع نور و کندانسور نصب کند و فیلتر مسدود کننده مربوطه را در پشت عدسی شیئی نصب کند. میکروسکوپ های اپی فلورسانس باید فیلتر تحریک مورد نیاز / شکاف پرتو دو رنگ / فیلتر مسدود کننده را در شکاف های مسیر نوری وارد کنند.
3. با عدسی با بزرگنمایی کم مشاهده کنید و مرکز منبع نور را طوری تنظیم کنید که مطابق با دستگاه تنظیم مدل های مختلف میکروسکوپ فلورسانس در مرکز کل نقطه نورانی قرار گیرد.
4. قطعه نمونه را قرار داده و پس از فوکوس مشاهده کنید. در هنگام استفاده باید توجه داشت: مستقیماً با فیلتر انتهایی مشاهده نکنید تا باعث آسیب به چشم نشود. هنگام مشاهده نمونه ها با لنز روغن، باید از یک لنز روغن مخصوص بدون فلورسانس استفاده کنید. پس از خاموش شدن لامپ جیوه فشار بالا، نمی توان آن را بلافاصله دوباره روشن کرد، باید آزمایش شود. بعد از 5 دقیقه می توان آن را مجددا راه اندازی کرد، در غیر این صورت ناپایدار خواهد بود و عمر لامپ جیوه ای را تحت تاثیر قرار می دهد.
(3) مشاهده با استفاده از فیلتر نور آبی-بنفش زیر میکروسکوپ فلورسنت بر روی سکوی آموزشی، می توان مشاهده کرد که o. 01 درصد از سلول های رنگ آمیزی شده با رنگ فلورسنت نارنجی آکریدین، هسته و سیتوپلاسم برای تولید دو رنگ مختلف فلورسانس (سبز تیره و قرمز نارنجی) برانگیخته می شوند.
