تفاوت بین میکروسکوپ فلورسانس (دو فوتون ، کانفوکال) و میکروسکوپ معمولی
اصل اساسی تحریک دو فوتونی این است که در چگالی فوتون بالا ، مولکول های فلورسنت می توانند به طور همزمان دو فوتون با طول موج بلند را جذب کرده و پس از یک دوره کوتاه به اصطلاح طول عمر هیجان زده ، یک فوتون طول موج کوتاه تر ساطع کنند. اثر همان استفاده از فوتون با نیمی از طول موج طول موج طولانی برای تحریک مولکول های فلورسنت است. دو تحریک فوتون نیاز به تراکم فوتون بالا دارد و برای جلوگیری از آسیب رساندن به سلول ها ، میکروسکوپ دو فوتونی از لیزرهای پالس قفل شده با انرژی بالا استفاده می کند. لیزر ساطع شده توسط این لیزر دارای انرژی اوج بالایی و انرژی متوسط پایین است و عرض پالس تنها 100 فموتوس ثانیه و فرکانس حداکثر 80 تا 100 مگا هرتز دارد. هنگام استفاده از یک لنز عینی دیافراگم عددی بالا برای تمرکز فوتون های لیزر پالس ، چگالی فوتون در نقطه کانونی لنز عینی بالاترین است و تحریک دو فوتونی فقط در نقطه کانونی لنزهای هدف رخ می دهد. بنابراین ، میکروسکوپ دو فوتونی نیازی به سوراخ کانفوکال ندارد ، که باعث افزایش کارایی تشخیص فلورسانس می شود.
به طور کلی پدیده های فلورسانس ، به دلیل چگالی فوتون کم نور تحریک ، یک مولکول فلورسنت فقط می تواند یک فوتون را در یک زمان جذب کند و سپس از طریق انتقال تابشی ، که به عنوان فلورسانس تک فوتون شناخته می شود ، یک فوتون فلورسنت دیگر را ساطع کند. برای فرآیندهای تحریک فلورسانس با استفاده از لیزرها به عنوان منابع نوری ، ممکن است پدیده های فلورسانس دو فوتونی یا حتی چندتایی رخ دهد. در این حالت ، منبع نور تحریک مورد استفاده از شدت بالا و تراکم فوتون برخوردار است که نیاز به مولکول های فلورسنت را برای جذب دو فوتون به طور همزمان برآورده می کند. در فرآیند استفاده از لیزر عمومی به عنوان منبع نور تحریک ، چگالی فوتون هنوز برای تولید پدیده جذب دو فوتونی کافی نیست. به طور معمول ، از لیزرهای پالس Femtosecond استفاده می شود که قدرت آنی به سطح مگاوات می رسد. بنابراین ، طول موج فلورسانس دو فوتونی کوتاه تر از نور تحریک است ، معادل اثر تولید شده توسط نیمی از تحریک طول موج.
دانش مربوط به میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال
اصل اساسی میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال استفاده از یک منبع نور نقطه برای تابش نمونه است و یک نقطه نور کوچک به خوبی تعریف شده در صفحه کانونی تشکیل می دهد. فلورسانس ساطع شده از این نقطه پس از تابش توسط لنز عینی جمع آوری می شود و در طول مسیر تابش اصلی به شکاف پرتو متشکل از یک آینه دوتایی ارسال می شود. طیف سنج فلورسانس را مستقیماً به ردیاب می فرستد. در مقابل منبع نور و آشکارساز به ترتیب یک سوراخ سوراخ وجود دارد ، به ترتیب ، سوراخ نور و سوراخ تشخیصی. ابعاد هندسی این دو سازگار است ، تقریباً {1}} nm ؛ در مقایسه با نقطه نور موجود در صفحه کانونی ، این دو به هم پیوسته اند ، به این معنی که نقطه نور از طریق یک سری لنزها عبور می کند و در نهایت می تواند بر روی سوراخ روشن و سوراخ کردن همزمان متمرکز شود. به این ترتیب ، نور از هواپیمای کانونی می تواند در محدوده سوراخ تشخیص همگرا شود ، در حالی که نور پراکنده از بالا یا زیر صفحه کانونی در خارج از سوراخ تشخیص مسدود شده و نمی توان تصویربرداری کرد. با اسکن نقطه نمونه به نقطه با لیزر ، لوله فوتومولتیپیلر پس از تشخیص سوراخ سوراخ نیز تصویر کانفوکال مربوطه از نقطه نقطه نور را به صورت نقطه به دست می آورد ، آن را به یک سیگنال دیجیتال تبدیل می کند و آن را به رایانه منتقل می کند و در نهایت آن را به یک تصویر کانفوکال واضح از کل صفحه کانونی در صفحه تبدیل می کند.
