روش استاندارد برای کالیبره کردن پلاریزه کننده ها در میکروسکوپ پلاریزه کننده
میکروسکوپ فلورسانس با میکروسکوپ نوری معمولی متفاوت است زیرا نمونه ها را در زیر نور منابع نور معمولی مشاهده نمی کند. در عوض، از طول موج مشخصی از نور (معمولاً نور ماوراء بنفش، نور بنفش آبی) برای تحریک مواد فلورسنت داخل نمونه در زیر میکروسکوپ استفاده می کند و باعث می شود آنها فلورسانس ساطع کنند. بنابراین، نقش منبع نور در میکروسکوپ فلورسانس، روشنایی مستقیم نیست، بلکه به عنوان یک منبع انرژی برای تحریک مواد فلورسنت داخل نمونه است. دلیل اینکه ما می توانیم نمونه ها را مشاهده کنیم به دلیل روشنایی منبع نور نیست، بلکه پدیده فلورسانس است که توسط مواد فلورسنت داخل نمونه پس از جذب انرژی نوری برانگیخته به نمایش گذاشته می شود. از این رو می توان دریافت که ویژگی میکروسکوپ فلورسانس عمدتاً این است که منبع نور آن می تواند مقدار زیادی نور تحریک را در یک محدوده طول موج مشخص تامین کند، به طوری که مواد فلورسنت موجود در نمونه می توانند شدت نور تحریک لازم را به دست آورند. در عین حال، میکروسکوپ های فلورسانس باید دارای سیستم های فیلتر مربوطه باشند. میکروسکوپ فلورسانس یک ابزار اساسی در شیمی بافت فلورسانس است. از اجزای اصلی مانند منبع نور فوق- ولتاژ بالا، سیستم فیلتر (شامل صفحات فیلتر تحریک و سرکوب)، سیستم نوری و سیستم عکاسی تشکیل شده است. از نور با طول موج معین برای تحریک نمونه و انتشار فلورسانس استفاده می کند.
1. روش های تحریک فلورسانس: با توجه به محدوده طول موج نور، دو نوع وجود دارد: روش تحریک UV (با استفاده از نور فرابنفش) و روش تحریک BV (با استفاده از نور بنفش آبی). روش تحریک UV از نور ماوراء بنفش نزدیک کمتر از 400 نانومتر برای تحریک استفاده می کند. این روش دارای نور تحریک مرئی نیست، بنابراین فلورسانس مشاهده شده فلورسانس ذاتی رنگ را نشان می دهد و تشخیص فلورسانس خاص روی نمونه را از خود فلورسانس بافت زمینه آسان می کند.
2. روش تحریک BV: شامل تحریک از نور ماوراء بنفش به نور آبی با محوریت 404 نانومتر و 434 نانومتر است. این روش از نور آبی برای تابش نمونه استفاده میکند، بنابراین فیلتر قطع شده سیستم مشاهده فلورسانس باید از فیلتری استفاده کند که بتواند نور آبی را کاملاً مسدود کند و به طور کامل از فلورسانس سبز و زرد مورد نیاز عبور کند. رنگدانه های فلورسنت مورد استفاده برای روش آنتی بادی فلورسنت. حداکثر طول موج جذب نور تحریک و حداکثر طول موج انتشار فلورسانس نسبتا نزدیک است، بنابراین فیلتر مورد استفاده در روش تحریک BV باید از فیلتر برش تیز استفاده کند. این روش می تواند از نور آبی به عنوان نور تحریک استفاده کند، بنابراین راندمان جذب رنگدانه های فلورسنت بالا است و می توان تصاویر روشن تری به دست آورد. نقطه ضعف این است که فلورسانس زیر 500 نانومتر قابل مشاهده نیست، در حالی که فلورسانس بالای 500 نانومتر باعث می شود کل تصویر زرد به نظر برسد. در روش آنتی بادی فلورسنت، ویژگی عمدتاً توسط رنگ منحصر به فرد رنگدانه های فلورسنت تعیین می شود، بنابراین هنگام بحث در مورد ویژگی ظریف، اشکالات روش تحریک BV که در بالا ذکر شد اغلب تأثیر قابل توجهی دارند.
