شمارش مستقیم میکروارگانیسم ها با میکروسکوپ

شمارش مستقیم میکروارگانیسم ها با میکروسکوپ

اصل تجربی
شمارش مستقیم زیر میکروسکوپ با استفاده از هموسیتومتر یک روش رایج شمارش میکروبی است. مزیت این روش این است که بصری و سریع است. سوسپانسیون باکتریایی رقیق شده (یا سوسپانسیون اسپور) را در محفظه شمارش بین لام و شیشه پوشش هموسیتومتر قرار دهید و زیر میکروسکوپ بشمارید. از آنجایی که حجم محفظه شمارش ثابت است (0.1 میلی‌متر مربع)، می‌توان آن را با توجه به تعداد میکروارگانیسم‌های مشاهده شده در زیر میکروسکوپ به تعداد کل میکروارگانیسم‌ها در واحد حجم تبدیل کرد. از آنجایی که این روش مجموع باکتری های زنده و مرده را شمارش می کند، روش شمارش کل باکتری ها نیز نامیده می شود.

هموسیتومتر معمولاً یک اسلاید شیشه ای ویژه است که چهار شیار روی آن سه سکو را تشکیل می دهند. سکو در وسط توسط یک شیار افقی کوتاه به دو نیمه تقسیم می شود. در هر طرف یک شبکه روی سکو حک شده است. هر شبکه به 9 مربع بزرگ تقسیم می شود. مربع بزرگ در وسط اتاق شمارش است. میکروارگانیسم ها در محفظه شمارش شمارش می شوند. ساختار تابلوی شمارش سلول های خونی در شکل Ⅷ-1 نشان داده شده است.

مقیاس اتاق شمارش به طور کلی دو مشخصه دارد، یکی اینکه یک مربع بزرگ به 16 مربع میانی و هر مربع میانی به 25 مربع کوچک تقسیم می شود (شکل Ⅷ-2). دیگری یک مربع بزرگ است. مربع به 25 مربع میانی و هر مربع وسط به 16 مربع کوچک تقسیم می شود (شکل Ⅷ{5}}، ج). اما مهم نیست که چه نوع تخته شماری باشد، تعداد مربع های کوچک در هر مربع بزرگ یکسان است، یعنی 16×25=400 مربع کوچک، همانطور که در شکل Ⅷ-2 نشان داده شده است.

طول ضلع هر مربع بزرگ 1 میلی متر و مساحت هر مربع بزرگ 1 میلی متر مربع است. پس از پوشاندن شیشه روکش، ارتفاع بین شیشه کشویی و شیشه روکش 0.1 میلی متر است، بنابراین حجم محفظه شمارش 0.1 میلی متر مکعب است.

هنگام شمارش، معمولاً تعداد کل باکتری ها را در پنج شبکه میانی بشمارید، سپس مقدار متوسط ​​هر شبکه میانی را به دست آورید و سپس در 16 یا 25 ضرب کنید تا تعداد کل باکتری ها در یک شبکه بزرگ به دست آید و سپس به عدد تبدیل شود. تعداد کل باکتری ها در 1 میلی لیتر محلول باکتری.

تجهیزات آزمایشگاهی
هموسیتومتر، میکروسکوپ، پوشش، مویرگی استریل.

مواد آزمایشی
سوسپانسیون ساکارومایسس سرویزیه

روش آزمایشی (روش شمارش مستقیم میکروسکوپ میکروبی)
1. رقیق سازی
سوسپانسیون ساکارومایسس سرویزیه را به درستی رقیق کنید. اگر محلول باکتری غلیظ نباشد، نیازی به رقیق شدن ندارد.
 

2. اتاق شمارش میکروسکوپی
قبل از افزودن نمونه ها، یک بازرسی میکروسکوپی از محفظه شمارش صفحه شمارش انجام دهید. اگر کثیفی وجود دارد، قبل از شمارش باید تمیز شود.
 

3. نمونه اضافه کنید
روی صفحه هموسیتومتر تمیز و خشک را با یک لیوان پوششی بپوشانید و سپس از قطره چکان دهان ریز استریل استفاده کنید تا قطره کوچکی از محلول ساکارومایسس سرویزیه رقیق شده را از لبه شیشه پوشش (نه خیلی زیاد) به طوری که محلول باکتری باشد. نزدیک به شکاف در امتداد شکاف است. اسمز مویرگی به خودی خود وارد محفظه شمارش می شود و محفظه شمارش عمومی را می توان با مایع باکتریایی پر کرد. مراقب باشید حباب هوا نداشته باشید.
 

4. شمارش میکروسکوپ
پس از 5 دقیقه استراحت، هموسیتومتر را روی صحنه میکروسکوپ قرار دهید، ابتدا از یک لنز کم توان برای یافتن محل محفظه شمارش استفاده کنید و سپس برای شمارش به عدسی با قدرت بالا بروید. اگر قبل از شمارش مشخص شد که محلول باکتری خیلی غلیظ یا خیلی نازک است، لازم است قبل از شمارش، رقت را مجدداً تنظیم کنید. به طور کلی، رقت نمونه به حدود 5-10 باکتری در هر سلول نیاز دارد. هر محفظه شمارش باکتری ها را در 5 شبکه میانی (اختیاری 4 گوشه و شبکه مرکزی) برای شمارش انتخاب می کند. باکتری های روی خط شبکه عموماً فقط روی خطوط بالا و راست شمارش می شوند. در صورت جوانه زدن مخمر، زمانی که اندازه بدن جوانه به نصف سلول مادر می رسد، دو باکتری بشمارید. برای محاسبه محتوای باکتریایی نمونه از مقادیر شمارش شده در دو محفظه شمارش یک نمونه بشمارید.
 

5. تمیز کردن هموسیتومتر
پس از استفاده، صفحه شمارش گلبول روی شیر آب را با جت آب بشویید، آن را با اجسام سفت نشویید و پس از شستن به تنهایی یا با سشوار خشک کنید. با بررسی میکروسکوپی، مشاهده کنید که آیا باکتری های باقیمانده یا رسوبات دیگری در هر سلول وجود دارد یا خیر. در صورت تمیز نبودن باید بارها شسته شود تا تمیز شود.