تفاوت ها و ویژگی های بین میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ نوری معمولی
میکروسکوپ فلورسانس با میکروسکوپ نوری معمولی متفاوت است. این نمونه را از طریق روشنایی منبع نور معمولی مشاهده نمی کند. در عوض، از نور با طول موج معین (معمولاً نور ماوراء بنفش، نور آبی-بنفش) برای تحریک مواد فلورسنت در نمونه زیر میکروسکوپ استفاده می کند و باعث می شود که فلورسانس ساطع شود. بنابراین، منبع نور یک میکروسکوپ فلورسانس به عنوان نور مستقیم عمل نمی کند، بلکه به عنوان یک منبع انرژی است که مواد فلورسنت داخلی نمونه را تحریک می کند. دلیل اینکه ما می توانیم نمونه را مشاهده کنیم به دلیل روشنایی منبع نور نیست، بلکه پدیده فلورسانس ناشی از جذب انرژی نور برانگیخته توسط ماده فلورسنت در نمونه است. مشاهده می شود که مشخصه اصلی یک میکروسکوپ فلورسانس این است که منبع نور آن می تواند مقدار زیادی نور تحریک را در یک محدوده طول موج مشخص تامین کند، به طوری که مواد فلورسنت در نمونه مورد بررسی می توانند شدت نور تحریک لازم را به دست آورند. در عین حال، میکروسکوپ های فلورسانس باید دارای سیستم های فیلتر مربوطه باشند. میکروسکوپ فلورسانس یک ابزار ضروری برای هیستوشیمی فلورسانس پیشرفته است. از منبع نور فوق فشار بالا، سیستم فیلتر (شامل صفحات فیلتر تحریک و سرکوب)، سیستم نوری و سیستم عکاسی تشکیل شده است. از نور با طول موج معین برای تحریک نمونه برای انتشار فلورسانس استفاده می کند.
1. راه های برانگیختن فلورسانس: با توجه به محدوده طول موج نور، به دو نوع روش تحریک UV (با استفاده از روش روشنایی فرابنفش) و روش تحریک BV (با استفاده از نور آبی-بنفش) تقسیم می شود. روش تحریک UV از نور نزدیک به فرابنفش کمتر از 400 نانومتر برای تحریک استفاده می کند. در این روش نور تحریک مرئی وجود ندارد، بنابراین فلورسانس مشاهده شده فلورسانس ذاتی رنگ را نشان می دهد و تشخیص فلورسانس خاص روی نمونه را از اتوفلورسانس بافت زمینه آسان می کند.
2. روش تحریک BV: تحریک از نور ماوراء بنفش به نور آبی با محوریت 404 نانومتر و 434 نانومتر. در این روش از نور آبی برای روشن کردن نمونه استفاده می شود، بنابراین فیلتر قطع کننده سیستم مشاهده فلورسانس باید از فیلتری استفاده کند که بتواند نور آبی را کاملاً مسدود کند و فلورسانس سبز و زرد مورد نیاز را به طور کامل عبور دهد. رنگ های فلورسنت مورد استفاده در روش های آنتی بادی فلورسنت. حداکثر طول موج جذب نور تحریک و حداکثر طول موج انتشار فلورسانس نسبتا نزدیک است، بنابراین فیلتر مورد استفاده در روش تحریک BV باید از فیلتر قطع تیز استفاده کند. در این روش می توان از نور آبی به عنوان نور تحریک استفاده کرد، بنابراین راندمان جذب رنگدانه های فلورسنت بیشتر است و می توان تصاویر روشن تری به دست آورد. نقطه ضعف این است که فلورسانس زیر 500 نانومتر قابل مشاهده نیست، در حالی که فلورسانس بالای 500 نانومتر باعث می شود کل تصویر زرد به نظر برسد. در روش آنتی بادی فلورسنت، ویژگی رنگ فلورسنت بیشتر بر اساس رنگ منحصر به فرد آن قضاوت می شود. بنابراین، هنگام بحث در مورد ویژگی ظریف، کاستی های ذکر شده در روش تحریک BV اغلب تأثیر زیادی دارند.
