تعیین تعداد میکروارگانیسم ها - روش شمارش مستقیم میکروسکوپ!
رشد جمعیت باکتریایی با افزایش تعداد سلول یا افزایش توده سلولی آشکار می شود. روش های تعیین تعداد سلول ها شامل روش شمارش میکروسکوپ مستقیم، روش شمارش کلونی صفحه، روش نسبت روغن فوتوالکتریک، روش حداکثر احتمال و روش فیلتراسیون غشایی می باشد. روش های اندازه گیری ماده سلولی شامل تعیین وزن خشک سلول، تعیین برخی اجزای سلولی مانند نیتروژن، RNA و محتوای DNA و تعیین متابولیت ها می باشد. به طور خلاصه، روش های زیادی برای اندازه گیری رشد میکروارگانیسم ها وجود دارد که هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارند و باید با توجه به شرایط خاص انتخاب شوند. این آزمایش عمدتاً روش شمارش مستقیم میکروسکوپی را که معمولاً در تولید و تحقیقات علمی مورد استفاده قرار میگیرد، معرفی میکند.
1. الزامات هدف
1. اصل شمارش سلول های خونی را روشن کنید.
2. بر روش شمارش میکروارگانیسم ها با استفاده از شمارنده سلول های خونی مسلط شوید.
2. اصول اولیه
روش شمارش مستقیم میکروسکوپی روشی ساده، سریع و شهودی برای شمارش مستقیم مقدار کمی از سوسپانسیون نمونه مورد آزمایش بر روی یک لام شیشه ای مخصوص با سطح و حجم معین (همچنین به عنوان شمارنده باکتری شناخته می شود) است. مواد و روش ها. در حال حاضر، شمارشگرهای باکتریایی رایج در داخل و خارج از کشور عبارتند از: تخته شمارش سلول های خون، شمارشگر باکتری پیتروف هاوزر و شمارشگر باکتری هاکسلی و غیره. می توان از آنها برای شمارش مخمر، باکتری، هاگ کپک و سایر سوسپانسیون ها استفاده کرد. اصل اساسی یکسان است. دو نوع اخیر شمارنده باکتری دارای حجم کل 0 هستند.02 میلی متر مکعب پس از پوشاندن با شیشه پوششی، و فاصله بین شیشه روکش و لام فقط 0.02 میلی متر است، بنابراین روغن از لنز شیئی غوطه وری می توان برای مشاهده و مشاهده سلول های کوچک مانند باکتری ها استفاده کرد. شمردن. علاوه بر این باکتریسنجها، یک روش تخمینی نیز برای نسبت مساحت اسمیر به ناحیه میدان بینایی که مستقیماً در زیر میکروسکوپ مشاهده میشود، وجود دارد که معمولاً برای بررسی باکتریشناسی شیر استفاده میشود. مزایای روش شمارش مستقیم میکروسکوپ بصری، سریع و آسان برای کار است. اما عیب این روش این است که نتیجه اندازه گیری شده معمولاً مجموع سلول های مرده و زنده است. در حال حاضر روش هایی برای غلبه بر این نقیصه وجود دارد، مانند ترکیبی از باکتری های زنده رنگ آمیزی کشت ریز محفظه ای (مدت کوتاه) و افزودن بازدارنده های تقسیم سلولی برای دستیابی به هدف شمارش تنها باکتری های زنده.
در این آزمایش از هموسیتومتر به عنوان نمونه برای شمارش میکروسکوپی مستقیم استفاده شد. برای استفاده از دو نوع دیگر شمارنده باکتری، لطفاً به دستورالعمل های هر سازنده مراجعه کنید. شمارش مستقیم زیر میکروسکوپ با هموسیتومتر یک روش رایج برای شمارش میکروارگانیسم ها است. صفحه شمارش یک اسلاید شیشه ای ویژه است که روی آن سه سکو توسط چهار شکاف تشکیل شده است. سکوی پهن تر در وسط توسط یک شکاف عرضی کوتاه به دو نیمه تقسیم می شود و در هر طرف سکو یک شبکه وجود دارد. هر شبکه به 9 مربع بزرگ تقسیم می شود و مربع بزرگ در وسط اتاق شمارش است. ساختار صفحه شمارش سلول های خونی در شکل l نشان داده شده است. مقیاس اتاق شمارش به طور کلی دارای دو مشخصه است، یکی مربع بزرگی است که به 25 مربع میانی تقسیم می شود و هر مربع وسط به 16 مربع کوچک تقسیم می شود (شکل 15-2). دیگری یک مربع بزرگ است. مربع به 16 مربع وسط و هر مربع وسط به 25 مربع کوچک تقسیم می شود، اما مهم نیست که چه نوع تخته شماری باشد، در هر مربع بزرگ 400 مربع کوچک وجود دارد. طول ضلع هر مربع بزرگ 1 میلی متر و مساحت هر مربع بزرگ 1 میلی متر مربع است. پس از پوشاندن با شیشه روکش، ارتفاع بین شیشه روکش و شیشه کشویی 0.1 میلی متر است، بنابراین حجم محفظه شمارش 0.lmm3 (یک هزارم میلی لیتر) است. شکل 15-1 ساختار تخته شمارش سلول های خونی (1) شکل 15-2 ساختار تخته شمارش سلول های خونی (2) الف. نمای جلو. ب. نمای مقطع طولی; شبکه بزرگ شده، مربع بزرگ در وسط اتاق شمارش 1 است. صفحه شمارش سلول های خون. 2. پوشش شیشه ای; 3. هنگام شمارش در محفظه شمارش، معمولاً تعداد کل باکتری ها را در پنج مربع بشمارید، سپس میانگین هر مربع را محاسبه کنید و در 25 یا 16 ضرب کنید تا تعداد کل باکتری ها در یک مربع بزرگ به عدد تبدیل شود. تعداد کل باکتری ها در 1 میلی لیتر محلول باکتریایی. تعداد کل باکتری ها در پنج مربع A و نسبت رقت محلول باکتری B باشد. اگر صفحه شمارشی با 25 مربع باشد، تعداد کل باکتری ها در 1 میلی لیتر محلول باکتریایی {{26} } A/5×25×104× B{30}}A·B(قطعات) به همین ترتیب، اگر صفحه شمارش با 16 مربع متوسط باشد، تعداد کل باکتری ها در 1 میلی لیتر محلول باکتریایی=A/ 5×16×104×B{37}}A·B (قطعات)
3. تجهیزات
1. باکتری
ساکارومایسس سرویزیه
2. ابزار یا وسایل دیگر
هموسیتومتر، میکروسکوپ، سرپوش، قطره چکان مویرگی استریل.
4. مراحل عملیات
1. تهیه سوسپانسیون باکتریایی
ساکارومایسس سرویزیه در یک سوسپانسیون باکتریایی با غلظت مناسب با سالین فیزیولوژیکی استریل تهیه شد.
2. اتاق شمارش میکروسکوپ
قبل از افزودن نمونه ها، محفظه شمارش صفحه شمارش را به صورت میکروسکوپی بازرسی کنید. در صورت وجود کثیفی، قبل از شمارش باید تمیز و خشک شود.
3. نمونه اضافه کنید
هموسیتومتر تمیز و خشک را با یک ورقه پوششی بپوشانید و سپس از یک قطره چکان مویرگی استریل استفاده کنید تا یک قطره کوچک از سوسپانسیون ساکارومایسس سرویزیه تکان داده شده را از لبه روکش بریزید و اجازه دهید محلول باکتری به طور خودکار در امتداد شکاف با اسمز مویرگی حرکت کند. با ورود به اتاق شمارش، اتاق شمارش عمومی را می توان با مایع باکتریایی پر کرد. هنگام نمونه برداری، ابتدا محلول باکتری را تکان دهید. هنگام افزودن نمونه ها، هیچ حباب هوا نباید در محفظه شمارش ایجاد شود.
4. شمارش میکروسکوپی
پس از افزودن نمونه به مدت 5 دقیقه بی حرکت بمانید، سپس هموسیتومتر را روی مرحله میکروسکوپ قرار دهید، ابتدا محل محفظه شمارش را با میکروسکوپ کم توان پیدا کنید و سپس برای شمارش به میکروسکوپ پرقدرت بروید. شدت نور میکروسکوپ را به طور مناسب تنظیم کنید. برای میکروسکوپ هایی که از آینه برای روشنایی استفاده می کنند، توجه داشته باشید که از یک طرف نور منحرف نشوند، در غیر این صورت به راحتی نمی توان خطوط مربع اتاق شمارش را به وضوح در میدان دید مشاهده کرد و یا فقط خطوط عمودی یا خطوط افقی را مشاهده کرد. دیده می شود. اگر مشخص شد که محلول باکتری قبل از شمارش خیلی غلیظ یا خیلی رقیق شده است، لازم است قبل از شمارش رقت مجدداً تنظیم شود. به طور کلی، رقت نمونه به حدود 5 تا 10 باکتری در هر سلول کوچک نیاز دارد. هر اتاق شمارش 5 سلول میانی (اختیاری 4 گوشه و یک سلول میانی در مرکز) را برای شمارش انتخاب می کند. سلول های واقع در خط شبکه عموماً فقط در خطوط بالا و راست شمارش می شوند. در مورد جوانه زدن مخمر، زمانی که اندازه جوانه به نصف سلول مادر برسد، به عنوان دو سلول باکتری محسوب می شود. برای شمارش نمونه، محتوای باکتریایی نمونه را با محاسبه مقدار متوسط از دو محفظه شمارش محاسبه کنید.
5. شمارش سلول های خونی را بشویید
پس از استفاده تخته شمارش گلبول های خون را با آب داخل شیر آب بشویید، با اجسام سفت مالش ندهید و پس از شستن آن را خودتان یا با سشوار خشک کنید. بررسی میکروسکوپی برای مشاهده اینکه آیا باکتری های باقیمانده یا رسوبات دیگری در هر سلول کوچک وجود دارد یا خیر. در صورت تمیز نبودن باید چندین بار شسته شود تا تمیز شود.
