هدف از میکروسکوپ کانفوکال چیست؟

هدف از میکروسکوپ کانفوکال چیست؟

1. پس از تلاش ها و پیشرفت های پیشینیان بزرگ ما، میکروسکوپ نوری به نقطه کمال رسیده است. در واقع میکروسکوپ های معمولی می توانند تصاویر میکروسکوپی زیبایی را به سادگی و به سرعت در اختیار ما قرار دهند. با این حال، رویدادی که نوآوری انقلابی را در این دنیای تقریباً کامل میکروسکوپ به ارمغان آورد، اتفاق افتاد که اختراع "میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری" است. ویژگی این نوع جدید میکروسکوپ این است که از یک سیستم نوری استفاده می کند که فقط اطلاعات تصویر را بر روی سطحی که فوکوس متمرکز شده است استخراج می کند و در حین تغییر فوکوس، اطلاعات به دست آمده را در حافظه تصویر بازیابی می کند، به طوری که اطلاعات سه بعدی کامل می شود. به دست آمده. تصویری تلخ از هوش. با این روش می توان به راحتی اطلاعاتی در مورد شکل سطح به دست آورد که با میکروسکوپ معمولی تایید نمی شود. علاوه بر این، برای میکروسکوپ های نوری معمولی، «افزایش وضوح» و «عمیق شدن عمق فوکوس» شرایط متناقضی هستند، به خصوص در بزرگنمایی های بالا، این تضاد بیشتر به چشم می خورد، اما از نظر میکروسکوپ های کانفوکال، این مشکل به راحتی حل می شود.

2. مزایای سیستم نوری کانفوکال

نمودار شماتیک میکروسکوپ کانفوکال لیزری
سیستم نوری کانفوکال نور نقطه ای را بر روی نمونه انجام می دهد و نور منعکس شده نیز توسط گیرنده نقطه دریافت می شود. هنگامی که نمونه در موقعیت فوکوس قرار می گیرد، تقریباً تمام نور بازتاب شده می تواند به گیرنده نور برسد و زمانی که نمونه خارج از فوکوس باشد، نور بازتاب شده نمی تواند به گیرنده نور برسد. یعنی در سیستم نوری کانفوکال تنها تصویری که با نقطه کانونی منطبق است خروجی می شود و نقاط نور و نور پراکنده بی فایده محافظت می شود.

3. چرا از لیزر استفاده کنیم؟
در سیستم نوری کانفوکال، نمونه در یک نقطه روشن می شود و نور بازتاب شده نیز توسط یک گیرنده نوری نقطه ای دریافت می شود. بنابراین، یک منبع نور نقطه ای ضروری می شود. لیزرها منابع نور بسیار نقطه ای هستند. در بیشتر موارد، از منابع نور لیزر به عنوان منبع نور برای میکروسکوپ های کانفوکال استفاده می شود. علاوه بر این، ویژگی های تک رنگ، جهت و شکل پرتو عالی لیزر نیز دلایل مهمی برای پذیرش گسترده آن است.

4. مشاهده زمان واقعی بر اساس اسکن با سرعت بالا امکان پذیر می شود
برای اسکن لیزری، واحد انحراف نوری فعال شده با آکوستیک (Acoustic Optical Deflector، عنصر AO) در جهت افقی و آینه Servo Galvano در جهت عمودی استفاده می شود. از آنجایی که واحد انحراف آکوستو-اپتیکال هیچ بخش لرزش مکانیکی ندارد، می تواند اسکن با سرعت بالا را انجام دهد و مشاهده بلادرنگ روی صفحه نمایشگر امکان پذیر است. این تصویربرداری با سرعت بالا آیتم بسیار مهمی است که مستقیماً بر سرعت فوکوس و بازیابی موقعیت تأثیر می گذارد.

5. رابطه بین موقعیت فوکوس و روشنایی
در سیستم نوری کانفوکال، روشنایی نمونه زمانی حداکثر است که نمونه به درستی در موقعیت کانونی قرار گیرد و روشنایی آن قبل و بعد از آن به شدت کاهش می یابد (خط ثابت در شکل 4). گزینش پذیری حساس صفحه کانونی نیز اصل تعیین جهت ارتفاع میکروسکوپ کانفوکال و گسترش عمق کانونی است. در مقابل، میکروسکوپ های نوری معمولی تغییرات روشنایی قابل توجهی قبل و بعد از موقعیت فوکوس ندارند.

6. کنتراست بالا، وضوح بالا
در میکروسکوپ های نوری معمولی به دلیل تداخل نور بازتاب شده از قسمت فوکوس، با قسمت تصویربرداری فوکوس همپوشانی پیدا می کند و در نتیجه کنتراست تصویر کاهش می یابد. از طرفی در سیستم نوری کانفوکال نور پراکنده در خارج از نقطه کانونی و نور پراکنده در داخل عدسی شیئی تقریبا به طور کامل حذف می شود تا تصویری با کنتراست بسیار بالا بدست آید. علاوه بر این، چون نور دو بار از عدسی شیئی عبور می کند، ابتدا تصویر نقطه ای شارپ می شود که قدرت تفکیک میکروسکوپ را نیز بهبود می بخشد.

7. تابع محلی سازی نوری
در سیستم نوری کانفوکال، نور منعکس شده به غیر از نقطه منطبق با نقطه کانونی توسط ریز منفذ محافظت می شود. بنابراین، هنگام مشاهده یک نمونه سه بعدی، تصویری به گونه ای تشکیل می شود که گویی نمونه با صفحه کانونی بریده شده است (شکل 5). این اثر به محلی سازی نوری معروف است و یکی از تخصص های سیستم های نوری کانفوکال است.

8. تمرکز عملکرد حافظه تلفن همراه
به اصطلاح نور منعکس شده در خارج از نقطه کانونی توسط ریز منافذ محافظت می شود. از سوی دیگر، می توان در نظر گرفت که تمام نقاط روی تصویر که توسط سیستم نوری کانفوکال تشکیل شده اند، با نقطه کانونی منطبق هستند. بنابراین اگر نمونه سه بعدی در امتداد محور Z (محور نوری) حرکت کند، تصاویر انباشته و در حافظه ذخیره می شوند و در نهایت تصویر تشکیل شده از کل نمونه و نقطه کانونی به دست می آید. عملکرد بی نهایت عمیق کردن عمق فوکوس به این روش را عملکرد حافظه موبایل می نامند.

9. عملکرد اندازه گیری شکل سطح
از نظر عملکرد تغییر فوکوس، شکل سطح نمونه را می توان به صورت غیر تماسی با افزودن مدار ثبت ارتفاع سطح اندازه گیری کرد. بر اساس این تابع، می توان مختصات محور Z را که از حداکثر مقدار درخشندگی در هر پیکسل تشکیل می شود، ثبت کرد و بر اساس این اطلاعات، اطلاعات مربوط به شکل سطح نمونه به دست آمد.

10. عملکرد اندازه گیری میکرو اندازه با دقت بالا
واحد دریافت نور از یک سنسور تصویربرداری CCD 1-بعدی استفاده می‌کند، بنابراین تحت تأثیر شیب اسکن دستگاه اسکن قرار نمی‌گیرد تا اندازه‌گیری با دقت بالا تکمیل شود. علاوه بر این، به دلیل استفاده از عملکرد حافظه تغییر فوکوس با قابلیت تنظیم عمق فوکوس (عمیق شدن)، خطای اندازه گیری ناشی از تغییر فوکوس را می توان حذف کرد.

11. تجزیه و تحلیل تصویر سه بعدی
با استفاده از تابع اندازه گیری شکل سطح می توانید به راحتی تصویری سه بعدی از سطح نمونه ایجاد کنید. نه تنها این، بلکه می تواند تجزیه و تحلیل های مختلفی مانند اندازه گیری زبری سطح، مساحت، حجم، سطح، دایره، شعاع، حداکثر طول، محیط، مرکز ثقل، تصویر توموگرافی، تبدیل FFT، اندازه گیری عرض خط و غیره را انجام دهد. .
میکروسکوپ اسکن کانفوکال لیزری نه تنها برای مشاهده مورفولوژی سلول، بلکه برای تجزیه و تحلیل کمی اجزای بیوشیمیایی داخل سلولی، آمار چگالی نوری و اندازه‌گیری مورفولوژی سلولی نیز قابل استفاده است.