میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی مزایای زیادی دارد:
1) طول موج های بلندتر نور کمتر تحت تاثیر پراکندگی قرار می گیرند تا طول موج های کوتاه نور برای نفوذ در نمونه.
(2) مولکول های فلورسنت خارج از صفحه کانونی برانگیخته نمی شوند تا نور تحریک بیشتری بتواند به صفحه کانونی برسد، به طوری که نور تحریک بتواند به عمق نمونه نفوذ کند.
3) طول موج‌های طولانی‌تر نور نزدیک به مادون قرمز نسبت به طول‌موج‌های کوتاه‌تر برای سلول‌ها سمیت کمتری دارند.
4) هنگام استفاده از میکروسکوپ دو فوتونی برای مشاهده یک نمونه، نور سفید و سمیت نوری فقط در سطح کانونی وجود دارد. بنابراین، میکروسکوپ‌های دو فوتونی برای مشاهده نمونه‌های ضخیم، برای مشاهده سلول‌های زنده یا برای انجام آزمایش‌های فوتوبلیچینگ نقطه‌ای مناسب‌تر از میکروسکوپ‌های تک فوتونی هستند.
دانش میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال
اصل اساسی میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال: یک منبع نور نقطه ای برای تابش نمونه استفاده می شود که یک نقطه نوری کوچک و کاملاً مشخص را در صفحه کانونی تشکیل می دهد. فلورسانس ساطع شده از این نقطه پس از تابش توسط عدسی شیئی جمع آوری شده و به پرتو شکاف متشکل از یک آینه رنگی دو جهته در امتداد مسیر نور تابش اصلی ارسال می شود. تقسیم کننده پرتو فلورسانس را مستقیماً به آشکارساز می فرستد. منبع نور و آشکارساز هر کدام یک سوراخ در جلوی خود دارند که به ترتیب سوراخ روشنایی و پین‌هول تشخیص نامیده می‌شوند. هر دو دارای هندسه یکسان هستند، حدود 100-200 نانومتر، و نسبت به نقطه نور در صفحه کانونی مزدوج هستند، یعنی نقطه نور از یک سری عدسی می گذرد و در نهایت می توان روی هر دو نور متمرکز شود. و سوراخ های آشکارساز. به این ترتیب، نور از صفحه کانونی می تواند در دیافراگم کاوشگر همگرا شود، در حالی که نور پراکنده از بالا یا پایین صفحه کانونی در خارج از دیافراگم پروب مسدود می شود و نمی توان تصویربرداری کرد. لیزر نقطه به نقطه نمونه را اسکن می کند و لوله فتومولتیپلایر پس از تشخیص سوراخ سوزن نیز تصویر هم کانونی نقطه به نقطه نور مربوطه را به دست می آورد که به سیگنال دیجیتال تبدیل شده و به کامپیوتر منتقل می شود و در نهایت به یک واضح همگرا می شود. تصویر هم کانونی از کل صفحه کانونی روی صفحه نمایش.
هر تصویر سطح کانونی در واقع یک مقطع نوری از نمونه است و این سطح مقطع نوری همیشه دارای ضخامت خاصی است که به آن صفحه نوری نیز می گویند. از آنجایی که شدت نور در نقطه کانونی بسیار بیشتر از نقطه غیر کانونی است، و نور صفحه غیر کانونی توسط سوراخ سوراخ فیلتر می شود، عمق میدان سیستم کانفوکال به طور تقریبی صفر است و اسکن می شود. در امتداد جهت محور Z، توموگرافی اپتیکال را قادر می سازد تا یک برش نوری دو بعدی از نمونه را تشکیل دهد تا در نقطه کانونی مشاهده شود. با ترکیب اسکن صفحه XY (صفحه کانونی) با اسکن محور Z (محور نوری)، می توان با تجمع لایه های متوالی تصاویر دو بعدی که توسط نرم افزارهای کامپیوتری تخصصی پردازش می شوند، یک تصویر سه بعدی از نمونه به دست آورد.
این بدان معنی است که سوراخ تشخیص و سوراخ سوزن منبع نور همیشه در یک نقطه متمرکز هستند، به طوری که فلورسانس برانگیخته خارج از صفحه کانونی نمی تواند وارد سوراخ تشخیص شود.
اصل کار لیزر کانفوکال به سادگی بیان شده است که از لیزر به عنوان منبع نور، بر اساس تصویربرداری میکروسکوپ فلورسانس سنتی، دستگاه اسکن لیزری اضافی و دستگاه فوکوس مزدوج، از طریق کنترل کامپیوتری برای انجام سیستم اکتساب و پردازش تصویر دیجیتال استفاده می‌کند.
