میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی مزایای زیادی دارد

میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی مزایای زیادی دارد

1) نور با طول موج بلند کمتر از نور با طول موج کوتاه تحت تأثیر پراکندگی قرار می گیرد و به راحتی می تواند به نمونه نفوذ کند.

2) مولکول های فلورسنت خارج از صفحه کانونی برانگیخته نمی شوند، اجازه می دهد نور تحریک بیشتری به صفحه کانونی برسد، و به نور تحریک اجازه می دهد تا به نمونه های عمیق تر نفوذ کند.

3) نور نزدیک به مادون قرمز با طول موج بلند نسبت به نور با طول موج کوتاه کمتر برای سلول ها سمی است.

4) هنگام مشاهده نمونه ها با استفاده از میکروسکوپ دو فوتونی، نور سفید و سمیت نوری فقط در سطح کانونی رخ می دهد. بنابراین، میکروسکوپ‌های دو فوتونی برای مشاهده نمونه‌های ضخیم، مشاهده سلول‌های زنده یا انجام آزمایش‌های فوتوبلیچینگ نقطه ثابت مناسب‌تر از میکروسکوپ‌های تک فوتونی هستند.

دانش در مورد میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال
اصل اساسی میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال: از یک منبع نور نقطه ای برای روشن کردن نمونه استفاده کنید تا یک نقطه نوری کوچک و کاملاً مشخص در صفحه کانونی ایجاد کنید. فلورسانس ساطع شده از نقطه پس از روشن شدن توسط عدسی شیئی جمع آوری شده و در امتداد مسیر نور روشنایی اصلی به آینه دو رنگی باز می گردد. یک تقسیم کننده پرتو را تشکیل می دهند. طیف سنج فلورسانس را مستقیماً به آشکارساز می فرستد. یک سوراخ در جلوی منبع نور و آشکارساز وجود دارد که به ترتیب به آنها سوراخ روشنایی و پین‌هول تشخیص می‌گویند. ابعاد هندسی این دو یکسان است، حدود 100-200nm. نسبت به نقطه نور در صفحه کانونی، این دو مزدوج هستند، یعنی نقطه نوری از یک سری عدسی عبور می کند و در نهایت می تواند همزمان روی سوراخ روشنایی و سوراخ تشخیص متمرکز شود. به این ترتیب، نور صفحه کانونی را می توان در سوراخ تشخیص متمرکز کرد، در حالی که نور پراکنده از بالا یا پایین صفحه کانونی در خارج از سوراخ تشخیص مسدود می شود و نمی توان تصویربرداری کرد. نمونه با لیزر نقطه به نقطه اسکن می شود و لوله فوتو ضربدر پشت سوراخ تشخیص نیز تصویر هم کانونی نقطه به نقطه نور مربوطه را به دست می آورد که به سیگنال دیجیتال تبدیل شده و به کامپیوتر منتقل می شود و در نهایت جمع می شود. روی صفحه به یک تصویر هم کانونی واضح از کل صفحه کانونی تبدیل شود. .

هر تصویر سطح کانونی در واقع یک مقطع نوری از نمونه است. این مقطع نوری همیشه ضخامت خاصی دارد و به آن مقطع نازک نوری نیز می گویند. از آنجایی که شدت نور در فوکوس بسیار بیشتر از شدت نور در غیر فوکوس است و نور صفحه غیر کانونی توسط سوراخ سوراخ فیلتر می شود، عمق میدان سیستم کانفوکال تقریباً صفر است. اسکن در امتداد جهت محور Z می تواند توموگرافی اپتیکال را انجام دهد و قسمت مورد نظر اپتیکال را در نقطه متمرکز نمونه مشاهده کنید. با ترکیب اسکن سطح XY (صفحه کانونی) با اسکن محور Z (محور نوری)، با انباشته شدن سطوح پیوسته تصاویر دو بعدی و پردازش آنها با نرم افزارهای تخصصی کامپیوتری، می توان تصویری سه بعدی از نمونه به دست آورد.

یعنی سوراخ تشخیص و سوراخ سوزن منبع نور همیشه روی یک نقطه متمرکز هستند، به طوری که فلورسانس برانگیخته شده در خارج از صفحه فوکوس نمی تواند وارد سوراخ تشخیص شود.

بیان ساده اصل کار لیزر کانفوکال این است که از لیزر به عنوان منبع نور استفاده می کند. بر اساس تصویربرداری میکروسکوپ فلورسانس سنتی، یک دستگاه اسکن لیزری و یک دستگاه فوکوس مزدوج اضافه شده است و سیستم توسط یک کامپیوتر برای جمع‌آوری و پردازش تصاویر دیجیتال کنترل می‌شود.