روش اصلی مشاهده میکروسکوپ نوری، مشاهده فلورسانس است

روش اصلی مشاهده میکروسکوپ نوری، مشاهده فلورسانس است

فلورسانس به فرآیندی اطلاق می‌شود که در آن یک ماده فلورسنت تقریباً به طور همزمان با نوری با طول موج خاص تابش می‌کند نوری با طول موج بلندتر ساطع می‌کند (شکل 1). هنگامی که نور با طول موج خاص (طول موج تحریک) به مولکولی مانند نور فلوروفور برخورد می کند، انرژی فوتون توسط الکترون های مولکول جذب می شود. سپس، الکترون ها از حالت پایه (S0) به سطح انرژی بالاتر، حالت برانگیخته (S1') انتقال می یابند. این فرآیند تحریک① نامیده می شود. الکترون به مدت 10-9-10-8 ثانیه در حالت برانگیخته باقی می‌ماند و در طی آن الکترون مقداری انرژی② از دست می‌دهد. در طی فرآیند خروج الکترون ها از حالت برانگیخته (S1) و بازگشت به حالت پایه③، انرژی باقیمانده جذب شده در طول فرآیند تحریک آزاد می شود.

زمان ماندن مولکول فلورسنت در حالت برانگیخته، طول عمر فلورسانس است که عموماً در سطح نانوثانیه است و یک ویژگی ذاتی خود مولکول فلورسنت است. تصویربرداری طول عمر فلورسانس (FLIM) که از فناوری تصویربرداری طول عمر فلورسانس استفاده می کند، تصویربرداری طول عمر فلورسانس (FLIM) نامیده می شود. علاوه بر تصویربرداری شدت فلورسانس، اندازه‌گیری‌های عملکردی و دقیق‌تری را می‌توان برای به دست آوردن ترکیب مولکولی، برهمکنش‌های بین مولکولی و ریزمحیط مولکول‌ها به دست آورد. اطلاعاتی که بدست آوردن آنها با تصویربرداری نوری معمولی دشوار است.

یکی دیگر از ویژگی های مهم فلورسانس، تغییر استوکس، تفاوت در طول موج بین پیک های تحریک و انتشار است (شکل 2). به طور معمول طول موج انتشار بیشتر از طول موج تحریک است. این به این دلیل است که الکترون ها پس از تحریک ماده فلورسنت و قبل از آزاد کردن فوتون، بخشی از انرژی خود را از طریق فرآیند آرام سازی از دست می دهند. مشاهده مواد فلورسنت با تغییرات استوکس بزرگتر در زیر میکروسکوپ فلورسانس آسانتر است.

میکروسکوپ فلورسانس و مکعب فیلتر فلورسانس

میکروسکوپ فلورسانس یک میکروسکوپ نوری است که از خواص فلورسانس برای مشاهده و تصویربرداری استفاده می کند و به طور گسترده در زمینه های مختلفی مانند زیست شناسی سلولی، نوروبیولوژی، گیاه شناسی، میکروبیولوژی، آسیب شناسی و ژنتیک استفاده می شود. تصویربرداری فلورسانس دارای مزایای حساسیت بالا و ویژگی بالا است و برای مشاهده توزیع پروتئین‌ها و اندامک‌های خاص در بافت‌ها و سلول‌ها، مطالعه کولوکالیزاسیون و برهمکنش، ردیابی فرآیندهای دینامیک زندگی مانند تغییرات غلظت یون بسیار مناسب است. ، و غیره.

بیشتر مولکول‌های موجود در سلول‌ها فلورسانس نمی‌کنند و برای دیدن آن‌ها باید به صورت فلورسنت برچسب‌گذاری شوند. روش‌های زیادی برای برچسب‌گذاری فلورسنت وجود دارد، مانند برچسب‌گذاری مستقیم (مانند استفاده از DAPI برای برچسب‌گذاری DNA)، یا رنگ‌آمیزی ایمنی با استفاده از خواص اتصال آنتی‌ژنی آنتی‌بادی‌ها، یا استفاده از پروتئین‌های فلورسنت (مانند GFP، پروتئین فلورسنت سبز) برای برچسب‌گذاری پروتئین‌های هدف. ، و اتصال برگشت پذیر. رنگهای مصنوعی (مانند فورا{1}}) و غیره.

در حال حاضر میکروسکوپ فلورسانس به تجهیزات استاندارد تصویربرداری آزمایشگاه ها و بسترهای تصویربرداری مختلف تبدیل شده است و کمک خوبی برای آزمایش های روزانه ما است. میکروسکوپ‌های فلورسانس عمدتاً به سه دسته تقسیم می‌شوند: میکروسکوپ‌های فلورسانس قائم (مناسب برای برش)، میکروسکوپ‌های فلورسانس معکوس (مناسب برای سلول‌های زنده، با در نظر گرفتن برش دادن)، استریوسکوپ‌های فلورسنت (مناسب برای نمونه‌های بزرگ‌تر، مانند گیاهان زبرا، ماهی‌ها ) ، مداکا، اندام های موش / موش و غیره).

بلوک فیلتر فلورسانس جزء اصلی تصویربرداری فلورسانس میکروسکوپ است. از سه بخش تشکیل شده است: فیلتر تحریک، فیلتر انتشار و تقسیم کننده پرتو دو رنگ. در چرخ فیلتر نصب می شود. برای مثال، Leica DMi8 مجهز به 6-چرخ فیلتر موقعیت (شکل 3) است. تعداد موقعیت های چرخ های مختلف میکروسکوپ متفاوت خواهد بود و برخی از میکروسکوپ ها از اسلایدهای بلوک فیلتر استفاده می کنند.

بلوک فیلتر نقش مهمی در تصویربرداری فلورسانس ایفا می کند: فیلتر تحریک نور تحریک را برای تحریک نمونه انتخاب می کند و نور سایر طول موج ها را مسدود می کند. نوری که از فیلتر تحریک عبور می کند از آینه دو رنگ عبور می کند (وظیفه آن بازتاب نور تحریک و انتقال فلورسانس است) پس از بازتاب توسط عدسی شیئی متمرکز می شود، نمونه را تابش می کند و فلورسانس مربوطه را تحریک می کند. ، نور ساطع کرد. نور ساطع شده توسط عدسی شیئی جمع آوری می شود، از شکاف پرتو دو رنگ عبور می کند و به فیلتر انتشار می رسد. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است: طول موج تحریک 450-490 نانومتر است، آینه دو رنگی نور کمتر از 510 نانومتر را منعکس می‌کند، نوری بیش از 510 نانومتر را منتقل می‌کند و محدوده دریافت نور ساطع شده 520-560 نانومتر است.