ویژگی های فنی و مهارت های استفاده از میکروسکوپ فلورسانس دو فوتون

ویژگی های فنی و مهارت های استفاده از میکروسکوپ فلورسانس دو فوتون

میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی یک فناوری جدید است که میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری و فناوری تحریک دو فوتون را ترکیب می کند.

اصل اساسی تحریک دو فوتونی این است: در مورد چگالی فوتون بالا، مولکول های فلورسنت می توانند همزمان دو فوتون با طول موج بلند را جذب کنند و پس از یک دوره کوتاه مدت به اصطلاح حالت برانگیخته، فوتونی با طول موج کوتاهتر ساطع کنند. . ; این اثر مانند استفاده از یک فوتون با طول موج نصف طول موج بلند برای تحریک یک مولکول فلورسنت است. تحریک دو فوتونی به چگالی فوتون بالایی نیاز دارد. برای آسیب نرساندن به سلول ها، میکروسکوپ دو فوتونی از لیزرهای پالسی با حالت قفل شده با انرژی بالا استفاده می کند. لیزر ساطع شده توسط این لیزر دارای انرژی پیک بالا و انرژی متوسط ​​کم است، عرض پالس آن تنها 100 فمتو ثانیه است و دوره آن می تواند به 80 تا 100 مگاهرتز برسد. هنگام استفاده از یک لنز شیئی با دیافراگم عددی بالا برای فوکوس فوتون های لیزر پالسی، چگالی فوتون در نقطه کانونی عدسی شیئی بالاترین است و تحریک دو فوتونی فقط در نقطه کانونی عدسی شیئی رخ می دهد. میکروسکوپ دو فوتونی نیازی به سوراخ کانفوکال ندارد که کارایی تشخیص فلورسانس را بهبود می بخشد. این یک روش تحقیق مهم در زمینه های مورفولوژی، زیست شناسی سلولی مولکولی، علوم اعصاب و فارماکولوژی است.

1. پس زمینه پیدایش میکروسکوپ دو فوتونی - دو محدودیت میکروسکوپ کانفوکال لیزری سنتی:

1) یکی پدیده سمیت نوری است: زیرا سوراخ کانفوکال باید به اندازه کافی کوچک باشد تا تصویری با وضوح بالا بدست آورد، و دیافراگم کوچک قسمت بزرگی از فلورسانس ساطع شده از نمونه، از جمله فلورسانس ساطع شده از صفحه کانونی را مسدود می کند. بله، نور تحریک باید به اندازه کافی قوی باشد تا نسبت سیگنال به نویز کافی را بدست آورد. و لیزر با شدت بالا باعث می شود که رنگ فلورسنت در حین اسکن مداوم به سرعت محو شود و سیگنال فلورسنت با پیشرفت اسکن ضعیف تر و ضعیف تر می شود.

2) سمیت نوری مشکل دیگری است. تحت تابش لیزر، بسیاری از مولکول‌های رنگ فلورسنت سیتوتوکسین‌هایی مانند اکسیژن منفرد یا رادیکال‌های آزاد تولید می‌کنند، بنابراین زمان اسکن و چگالی توان نوری نور تحریک باید در آزمایش برای حفظ چگالی نمونه محدود شود. فعال. در تحقیق بر روی نمونه‌های فعال، به‌ویژه مراحل مختلف رشد و نمو نمونه‌های فعال، فوتوبلیچینگ و سمیت نوری این مطالعات را بسیار محدود می‌کند.

2. چرا می گویید میکروسکوپ های دو فوتونی عموماً نیازی به مجهز شدن به لیزرهای تحریک فرابنفش ندارند؟

میکروسکوپ دو فوتونی یک فناوری تحریک فلورسانس مبتنی بر اثر تحریک دو فوتون است: مولکول های رنگ فلورسنت را می توان با جذب دو فوتون کم انرژی به طور همزمان برانگیخت (فاصله زمانی بین دو فوتون که به مولکول های فلورسنت می رسند کمتر از 1 فمتوثانیه است. اثر تحریک آن می تواند معادل جذب یک فوتون پر انرژی با طول موج 1/2 باشد. به عنوان مثال، جذب دو فوتون در طول موج قرمز معادل یک مولکول جذب کننده اشعه ماوراء بنفش است. فوتون های با طول موج بلند به راحتی توسط سلول ها جذب نمی شوند، بنابراین سمیت نوری برای سلول های زنده کاهش می یابد و نور سفید نیز کاهش می یابد. به این ترتیب نه تنها عملکرد تحریک فرابنفش را ایفا می کند، بلکه از آسیب اشعه ماوراء بنفش به نمونه نیز جلوگیری می کند.

3. لیزر میکروسکوپ دو فوتونی چه ویژگی خاصی دارد؟

احتمال جذب دو فوتون بستگی به این دارد که دو فوتون فرودی چقدر از نظر مکان و زمان بر هم منطبق هستند (دو فوتون باید ظرف 10-18 ثانیه برسند). سطح مقطع جذب دو فوتون کوچک است و فقط فلوروفورها در مناطق با شار فوتون بزرگ برانگیخته می شوند. بنابراین، بیشتر لیزرهای مورد استفاده، لیزرهای تیتانیوم یاقوت کبود هستند که می توانند به سرعت اسکن پیکوثانیه یا فمتوثانیه دست یابند و قدرت پیک بسیار بالا و توان متوسط ​​پایینی دارند، به طوری که می توان نور سفید و سمیت نوری را کاهش داد یا از بین برد. مهمترین چیز این است که چگالی بسیار بالایی از فوتون ها را در یک محدوده کوچک ارائه دهیم که می تواند تحریک همزمان دو فوتون را تضمین کند.

4. مزایای تحریک دو فوتون چیست؟

1) انتخاب رنگ را افزایش دهید: محدوده نور تحریک لیزر سیستم کانونی (Ar، Ar/Kr، HeNe) 488 نانومتر - 647 نانومتر است. این به معنی آزمایش با رنگ های فلورسنت تحریک شده با اشعه ماوراء بنفش است، به عنوان مثال با DAPI، Hoescht. طول موج تحریک دو فوتون دو برابر تک فوتون است، بنابراین رنگ های برانگیخته شده توسط ماوراء بنفش می توانند توسط نور مادون قرمز نزدیک تحریک شوند.

2) کاهش فوتوبلیچینگ: به دلیل کاهش فوتوبلیچینگ، میزان موفقیت آزمایشات با استفاده از CFP/YFP برای انتقال انرژی رزونانس فلورسانس (FRET) افزایش می یابد.

3) به لنز شیئی خاصی نیاز نیست: از نظر سخت افزاری، تحریک رنگ های برانگیخته با اشعه ماوراء بنفش با طول موج نور نزدیک به مادون قرمز نیازی به اجزای نوری خاص UV ندارد.

4) نسبت سیگنال به نویز را بهبود بخشید: طول موج نور تحریک و طول موج نور ساطع شده تفاوت زیادی دارند که باعث بهبود نسبت سیگنال به نویز می شود.

5) بلیچینگ موضعی در نقطه کانونی: از آنجایی که تحریک فلورسانس فقط در نقطه کانونی هدف اتفاق می افتد، نیازی به سوراخ کانفوکال نیست. این امر تشخیص نور را بهبود می بخشد و نور سفید فقط در نقطه کانونی رخ می دهد.

6) نفوذ آسانتر به نمونه ها: نور طول موج مادون قرمز به راحتی توسط سلول ها پراکنده نمی شود و می تواند به نمونه های عمیق تر نفوذ کند.

5. در مقایسه با میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری، بزرگترین پیشرفت انجام شده توسط میکروسکوپ دو فوتونی چیست؟

1) کاهش فوتوبلیچینگ.

2) کاهش سمیت نوری.

3) پراکندگی آن آسان نیست و نفوذ در نمونه های ضخیم مانند برش های مغزی آسان تر است.