تکنیک های رنگ آمیزی و مشاهده میکروسکوپی میکروارگانیسم ها

تکنیک های رنگ آمیزی و مشاهده میکروسکوپی میکروارگانیسم ها

1. هدف

1.1 تکنیک های اساسی اسمیر میکروبی و رنگ آمیزی را بیاموزید.

1.2 به روش ساده رنگ آمیزی باکتری ها مسلط شوید.

1.3 ابتدا ویژگی های مورفولوژیکی باکتری ها را درک کنید و دانش نحوه استفاده از لنزهای روغنی و تکنیک های عملیات آسپتیک را تثبیت کنید.

2 اصول
لکه گیری و رنگ آمیزی باکتری ها یک تکنیک اساسی در آزمایشات میکروبیولوژی است. سلول های باکتریایی کوچک و شفاف هستند و شناسایی آنها را در زیر میکروسکوپ نوری معمولی دشوار می کند. آنها باید رنگ آمیزی شوند. از یک رنگ برای رنگ کردن باکتری ها استفاده می شود، به طوری که باکتری های رنگ شده تفاوت رنگ واضحی با زمینه ایجاد می کنند تا مورفولوژی و ساختار آنها با وضوح بیشتری مشاهده شود. این روش کارکرد آسانی دارد و برای مشاهده شکل کلی سلول های باکتریایی و آرایش باکتری ها مناسب است. رنگهای پایه معمولاً برای رنگ آمیزی ساده استفاده می شود. این به این دلیل است که در محلول های خنثی، قلیایی یا ضعیف اسیدی، سلول های باکتری معمولا دارای بار منفی هستند و زمانی که رنگ های بازی یونیزه می شوند، قسمت رنگرزی مولکول های آنها دارای بار مثبت است، بنابراین آنها قلیایی هستند. قسمت رنگ آمیزی رنگ به راحتی با باکتری ها ترکیب می شود و آنها را رنگ می کند. سلول های باکتریایی رنگ آمیزی شده به شدت با پس زمینه تضاد دارند و شناسایی آنها در زیر میکروسکوپ را آسان تر می کند. رنگ هایی که معمولاً برای رنگرزی ساده استفاده می شوند عبارتند از متیلن بلو، کریستال ویولت، فوشین بازی و غیره. وقتی باکتری ها قندها را تجزیه می کنند و اسید تولید می کنند و باعث افت pH محیط کشت می شوند، بار مثبت روی باکتری افزایش می یابد. در این زمان می توان از رنگ های اسیدی مانند ائوزین، اسید فوشین یا قرمز کنگو برای رنگ آمیزی استفاده کرد. قبل از رنگ آمیزی، باکتری ها باید ثابت شوند. این دو هدف دارد: یکی از بین بردن باکتری ها و چسبیدن آنها به لام شیشه ای. دیگری افزایش میل ترکیبی آنها به رنگ است. دو روش متداول استفاده گرمایش و تثبیت شیمیایی است. هنگام تثبیت، سعی کنید شکل اصلی سلول ها را حفظ کنید.

3 مواد

3.1 باکتری: باسیلوس سوبتیلیس 12-18h کشت مایل مواد مغذی آگار، استافیلوکوکوس اورئوس 24 ساعته کشت مایل مواد مغذی آگار، اشریشیا کلی 24 ساعته کشت مایل آگار مغذی، کشت مایل آگار مخمر نانوایی.

3.2 عامل رنگرزی: رنگ قلیایی متیلن بلو (یا رنگ بنفش کریستال اگزالات آمونیوم)، رنگ فوشین اسید کربولیک.

3.3 ابزار یا ظروف دیگر: میکروسکوپ، لامپ الکلی، لام، حلقه تلقیح، قفسه اسلاید، بطری دولایه (حاوی روغن سرو و زایلن)، بافت عدسی، نمک فیزیولوژیکی یا آب مقطر و غیره.

4. فرآیند: اسمیر → خشک کردن → تثبیت → رنگ آمیزی → شستشو → خشک کردن → معاینه میکروسکوپی.

5 مرحله
5.1 اسمیر: دو لام شیشه ای تمیز و بدون روغن بردارید. در شرایط استریل، یک قطره کوچک از نرمال سالین (یا آب مقطر) را روی هر مرکز لام شیشه ای بریزید. از یک حلقه تلقیح برای استریل کردن باکتری باسیلوس سوبتیلیس استفاده کنید. میکروکوکوس لوتئوس و اشریشیا کلی، کمی چمن باکتریایی را در قطرات آب روی سطح شیبدار انتخاب کنید، خوب مخلوط کنید و آن را در یک لایه نازک بمالید. اگر از اسمیر سوسپانسیون باکتریایی (یا کشت مایع) استفاده می‌کنید، می‌توانید از یک حلقه تلقیح برای برداشتن 2 تا 3 حلقه و استفاده مستقیم روی لام استفاده کنید. مراقب باشید که نمک فیزیولوژیک (آب مقطر) زیاد نریزید و باکتری ها را حذف نکنید و به طور یکنواخت و نه خیلی غلیظ بمالید.

5.2 خشک کردن به طور طبیعی در دمای اتاق خشک کنید. همچنین می توانید آن را کمی روی یک لامپ الکلی با طرف روکش شده رو به بالا گرم کنید تا خشک شود. اما دقت کنید که خیلی به شعله نزدیک نشوید، زیرا دمای زیاد باعث از بین رفتن مورفولوژی باکتری ها می شود.

5.3 تثبیت اگر از خشک کردن گرم استفاده شود، تثبیت و خشک کردن در یک مرحله ترکیب می شوند و روش مشابه خشک کردن است. لکه دار کنید، خشک کنید و حرارت دهید.

5.4 رنگ آمیزی: لام را صاف روی قفسه اسلاید قرار دهید و 1 تا 2 قطره محلول رنگ را روی اسمیر اضافه کنید (مناسب است محلول رنگ فقط لایه اسمیر را بپوشاند). با متیلن بلو پایه لو به مدت 1 تا 2 دقیقه رنگ آمیزی کنید و با اسید کربولیک فوشسین (یا کریستال ویولت آمونیوم اگزالات) حدود 1 دقیقه رنگ آمیزی کنید.

5.5 شستشو با آب: محلول رنگ را بریزید و به آرامی با آب لوله کشی از یک سر لام بشویید تا زمانی که آبی که از اسمیر پایین می آید بی رنگ شود. هنگام شستشو با آب، سطح پوشش داده شده را مستقیماً با آب نشویید. جریان آب نباید خیلی سریع یا خیلی زیاد باشد تا از ریزش لایه اسمیر جلوگیری شود.

5.6 خشک کردن: قطرات آب روی لام را تکان دهید و به طور طبیعی خشک کنید، با سشوار خشک کنید یا با کاغذ جاذب جذب کنید (مراقب باشید باکتری ها را پاک نکنید). 5.7 معاینه میکروسکوپی پس از خشک شدن اسمیر، معاینه میکروسکوپی انجام دهید. قبل از مشاهده با لنز روغنی، اسمیر باید کاملاً خشک شود.

6 نتایج مورفولوژی E. coli و Micrococcus luteus را که پس از رنگ‌آمیزی منفرد مشاهده شد، ترسیم کنید.