تکنیک های رنگ آمیزی و مشاهده میکروسکوپی میکروارگانیسم ها

تکنیک های رنگ آمیزی و مشاهده میکروسکوپی میکروارگانیسم ها

رنگ آمیزی ساده باکتری ها
1 اهداف

1.1 یادگیری تکنیک های اولیه اسمیر میکروبی و رنگ آمیزی.

1.2 تسلط بر روش ساده رنگ آمیزی باکتری ها.

1.3 برای آشنایی با ویژگی های مورفولوژیکی باکتری ها و تثبیت یادگیری استفاده از آینه روغن و تکنیک های عملیات آسپتیک.

2 اصل اسمیر و رنگ آمیزی باکتری ها یک تکنیک اساسی در آزمایشات میکروبیولوژی است. سلول های باکتری ها کوچک و شفاف هستند و در زیر میکروسکوپ نوری معمولی به راحتی قابل تشخیص نیستند و باید رنگ آمیزی شوند. استفاده از یک رنگ برای رنگ‌آمیزی باکتری‌ها، به طوری که ارگانیسم رنگ‌شده و پس‌زمینه، تفاوت رنگی واضح‌تری را تشکیل می‌دهند تا مورفولوژی و ساختار آنها با وضوح بیشتری مشاهده شود. انجام این روش آسان است و برای مشاهده شکل کلی ارگانیسم و ​​آرایش باکتری ها مناسب است. رنگ‌های قلیایی معمولاً برای رنگ‌آمیزی ساده استفاده می‌شوند، زیرا در محلول‌های خنثی، قلیایی یا ضعیف اسیدی، سلول‌های باکتری معمولاً دارای بار منفی هستند و زمانی که رنگ‌های قلیایی یونیزه می‌شوند، قسمت رنگ‌آمیزی مولکول‌های آنها دارای بار مثبت است، بنابراین بخش رنگ‌آمیزی رنگ‌های قلیایی می تواند به راحتی به باکتری ها متصل شود تا باکتری ها را رنگی کند. سلول های باکتریایی رنگ آمیزی شده به شدت با پس زمینه تضاد دارند و در زیر میکروسکوپ راحت تر قابل تشخیص هستند. رنگ‌هایی که معمولاً برای رنگ‌آمیزی ساده مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از مروسیانین آبی، کریستال بنفش و ترکیب پایه قرمز. هنگامی که با تجزیه باکتریایی قند، اسید تولید می شود به طوری که PH محیط کاهش می یابد، بار مثبت باکتری ها افزایش می یابد و سپس می توان در رنگ آمیزی قرمز، قرمز اسیدی یا قرمز کنگو و سایر رنگ های اسیدی استفاده کرد. باکتری ها باید قبل از رنگ آمیزی ثابت شوند. هدف آن دو چیز است: یکی از بین بردن باکتری ها و چسبیدن باکتری ها به لام. دوم افزایش میل ترکیبی آن برای رنگ است. دو روش معمولا استفاده می شود: گرمایش و تثبیت شیمیایی. سعی کنید مورفولوژی اصلی سلول ها را هنگام تثبیت حفظ کنید.

3 مواد
3.1 سویه Bacillus subtilis 12-18h کشت مایل مواد مغذی آگار، استافیلوکوکوس اورئوس حدود 24 ساعت کشت مایل مواد مغذی آگار، اشریشیاکلی 24 ساعته کشت مایل آگار مغذی، کشت مایل آگار مخمر نانوایی.

3.2 لکه متیلن آبی قلیایی Stain Lue (یا رنگ بنفش کریستال اگزالات آمونیوم)، رنگ قرمز ترکیب اسید کربولیک.

3.3 ابزار یا سایر لوازم میکروسکوپ، لامپ الکلی، اسلاید، حلقه تلقیح، نگهدارنده اسلاید، بطری دولایه (پر از روغن سدر و زایلن)، کاغذ میکروسکوپ، نمک فیزیولوژیکی یا آب مقطر و غیره.

4 روش اسمیر ← خشک کردن ← تثبیت ← رنگ آمیزی ← شستشو → خشک کردن → معاینه میکروسکوپی.

5 مرحله
5.1 اسمیر دو اسلاید تمیز و بدون روغن، هر کدام با یک قطره کوچک نمک (یا آب مقطر) در مرکز لام در شرایط آسپتیک، با یک حلقه تلقیح کننده به ترتیب از Bacillus subtilis، Garcinia micrococcus، بردارید تا به طور آسپتیک عمل کند. و اشرشیاکلی مایل به برداشتن خزه کوچک در قطره آب، مخلوط کردن و پوشش داده شده با یک فیلم. اگر سوسپانسیون باکتریایی (یا کشت مایع) اسمیر شود، می توان برای تلقیح حلقه حلقه 2 تا 3 حلقه مستقیماً روی لام استفاده کرد. توجه داشته باشید که نمک (آب مقطر) و باکتری ها نباید زیاد باشد و یکنواخت پخش شود، نه خیلی غلیظ.

5.2 خشک کردن به طور طبیعی در دمای اتاق خشک کنید. همچنین می توان آن را با حرارت دادن کمی بالای یک لامپ الکلی با سمت روکش شده به سمت بالا خشک کرد. با این حال، زیاد به شعله نزدیک نشوید، زیرا دمای بسیار بالا باعث از بین رفتن مورفولوژی باکتری ها می شود.

5.3 تثبیت اگر از خشک کردن حرارتی استفاده شود، تثبیت و خشک کردن در یک مرحله به همان روش خشک کردن ترکیب می شوند. اسمیر کنید، خشک کنید و حرارت دهید.

5.4 رنگ آمیزی لام را صاف روی قفسه لام قرار دهید، 1 تا 2 قطره محلول رنگ آمیزی را روی اسمیر اضافه کنید (محلول رنگ آمیزی که فقط لایه اسمیر را می پوشاند مناسب است). اسمیر را با ملانوکس آبی Lü's Basic Mellanox Blue به مدت 1 تا 2 دقیقه و با کربنات قرمز (یا بنفش کریستال آمونیوم اگزالات) برای حدود 1 دقیقه آغشته کنید.

5.5 شستشو محلول رنگ‌آمیزی را بریزید و به آرامی از یک سر لام با آب لوله کشی بشویید تا آبی که از اسمیر پایین می‌آید بی رنگ شود. هنگام آبکشی، اجازه ندهید آب به طور مستقیم برای شستن سطح پوشش داده شده جریان یابد. جریان آب نباید خیلی سریع یا خیلی زیاد باشد تا از جدا نشدن لایه اسمیر جلوگیری شود.

5.6 خشک کردن قطرات آب روی لام را تکان دهید تا به طور طبیعی خشک شود، می توان از کاغذ جاذب یا خشک کن برای جذب خشک استفاده کرد (مراقب باشید بدن باکتری را پاک نکنید). 5.7 معاینه میکروسکوپی اسمیر خشک شده و با میکروسکوپ بررسی می شود. اسمیر قبل از مشاهده با میکروسکوپ روغنی باید کاملاً خشک شود.

6 نتایج مورفولوژی E. coli و Micrococcus garciniae را پس از رنگ‌آمیزی تکی رسم کنید.

لکه گرم

1 هدف
1.1 درک اصل رنگ آمیزی گرم و اهمیت آن در طبقه بندی و شناسایی باکتری ها.

1.2 یادگیری و تسلط بر تکنیک رنگ آمیزی گرم و تثبیت یادگیری استفاده از عدسی روغنی میکروسکوپ نوری.