الزامات آماده سازی نمونه برای میکروسکوپ فلورسانس

الزامات آماده سازی نمونه برای میکروسکوپ فلورسانس

الزامات برای تهیه نمونه برای میکروسکوپ فلورسانس

(1) اسلاید شیشه ای

ضخامت شیشه کشویی باید بین 0 باشد.8-L2mm. یک اسلاید خیلی ضخیم از یک طرف نور بیشتری جذب می کند و از طرف دیگر نمی تواند نور تحریک را روی نمونه متمرکز کند. اسلایدها باید صاف، ضخامت یکنواخت و عاری از اتوفلورسانس آشکار باشند. گاهی اوقات از اسلایدهای کوارتز استفاده می شود.

(2) پوشش شیشه

ضخامت شیشه پوشش حدود 0.17 میلی متر، صاف است. برای تقویت نور تحریک می توان از شیشه پوشش تداخلی نیز استفاده کرد که یک شیشه پوششی مخصوص است که با چندین لایه مواد (مانند فلوراید منیزیم) پوشانده شده است که اثرات تداخلی متفاوتی بر نور با طول موج های مختلف دارد که می تواند فلورسانس صاف نور تحریک از آن عبور می کند و نور تحریک منعکس می شود و این نور تحریک منعکس شده می تواند نمونه را تحریک کند.

(3) نمونه

برش های بافت یا سایر نمونه ها نباید خیلی ضخیم باشند. اگر ضخامت بیش از حد ضخیم باشد، بیشتر نور تحریک در قسمت پایین نمونه مصرف می شود، در حالی که قسمت بالایی که مستقیماً توسط عدسی شیئی مشاهده می شود نمی تواند به طور کامل برانگیخته شود. علاوه بر این، فلورسانس ناشی از همپوشانی سلول ها یا ناخالصی ها، رنگ آمیزی غیر اختصاصی پس زمینه بر قضاوت تأثیر می گذارد.

(4) روغن آینه

به طور کلی، هنگام مشاهده نمونه‌ها با میکروسکوپ‌های فلورسانس میدان تاریک و میکروسکوپ‌های غوطه‌وری روغن، باید از روغن غوطه‌وری استفاده شود. بهتر است از روغن مخصوص غوطه وری غیر فلورسنت استفاده کنید. همچنین می توان به جای آن از گلیسیرین و پارافین مایع نیز استفاده کرد، اما ضریب شکست پایین است که تاثیر کمی بر کیفیت تصویر دارد.

درک مکعب نور میکروسکوپ فلورسانس

فلورسانس نوری است که الکترون های موجود در یک ماده انرژی نور را از حالت کم انرژی به حالت پرانرژی جذب می کنند و پس از بازگشت به حالت کم انرژی نور را آزاد می کنند. این نور تابشی غیر دما - لومینسانس است. یعنی: ماده نور موج کوتاه را جذب می کند، وارد حالت برانگیخته می شود و نور موج بلند ساطع می کند.

چه اتوفلورسانس ماده باشد، چه رنگ فلورسنت یا پروتئین فلورسنت که توسط همجوشی بیان می شود، باید توسط طول موج خاصی از نور (تحریک) برانگیخته شود. پس از مهاجرت الکترون ها و از دست دادن انرژی، نوری با طول موج بلند خاص (Emision) ساطع می کنند. ، که می تواند توسط سیستم تشخیص برای دستیابی به عملکرد شناسایی فلورسانس خاص جمع آوری شود.

مکعب نور فلورسنت چیست؟

در مشاهده و تصویربرداری میکروسکوپ فلورسانس، نور تحریک با طول موج خاص و نور تابش طول موج بلند مربوطه توسط مکعب نور فلورسانس ارائه می شود، به طوری که سیگنال فلورسانس را می توان با چشم غیر مسلح، صفحه نمایش یا دوربین جمع آوری کرد. بنابراین، مکعب نور فلورسانس تعیین می کند که چه چیزی را می توان تشخیص داد. دستگاه کلیدی سیگنال فلورسانس، ویژگی های آن شامل EX: پارامترهای فیلتر طول موج تحریک، EM: پارامترهای فیلتر طول موج انتشار و DM: پارامترهای آینه دوگانه است. مکعب نور DAPI میکروسکوپ فلورسانس یکپارچه Revolve را به عنوان مثال در نظر بگیرید، EX: 385/30، EM: 450/50، DM: 425.

The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >نور 425 نانومتری را می توان به EM منتقل کرد. فیلترهای انتشار EM برای جداسازی فلورسانس منتشر شده توسط فلوروفور از سایر عناصر نوری پس‌زمینه برای جداسازی نور استفاده می‌شوند. فیلترهای انتشار نور را در طول موج فلورسانس از طریق آینه دو رنگی عبور می دهند و در عین حال همه نورهای دیگری را که از منبع نور تحریک نشت می کنند (منعکس شده از نمونه یا اپتیک) مسدود می کنند. طول موج نور ساطع شده بیشتر از EM است که باید مشاهده شود، یعنی فقط نور در محدوده 25±450 نانومتر وارد سیستم تشخیص می شود. انتخاب مناسب فیلترهای EX، EM و دوگانگی‌های DM می‌تواند به محققین در دستیابی به نسبت سیگنال به نویز بالاتر (S/N) کمک کند.