اصول میکروسکوپ کانفوکال لیزری (LSCM)
یک میکروسکوپ کانفوکال لیزری از یک سوراخ روشنایی در پشت منبع نور و یک سوراخ تشخیص که در جلوی آشکارساز قرار می گیرد برای رسیدن به روشنایی نقطه و تشخیص نقطه استفاده می کند. نور حاصل از منبع نور به وسیله نوری که از سوراخ روشنایی ساطع می شود بر روی نقطه ای از صفحه کانونی نمونه متمرکز می شود و فلورسانس ساطع شده از آن نقطه در سوراخ تشخیص تصویربرداری می شود و هر نور ساطع شده خارج از آن نقطه توسط دستگاه مسدود می شود. سوراخ تشخیص سوراخ روشنایی و سوراخ تشخیص برای نقطه روشن یا شناسایی شده مزدوج هستند، به طوری که نقطه شناسایی نقطه کانونی و صفحه ای که نقطه شناسایی شده در آن قرار دارد صفحه هم کانونی است. کامپیوتر نقطه شناسایی شده را بر روی صفحه کامپیوتر به شکل یک نقطه تصویر نمایش می دهد. برای تولید یک تصویر کامل، یک سیستم اسکن در مسیر نوری، سطح کانونی نمونه را اسکن میکند و در نتیجه یک تصویر کانفوکال کامل تولید میکند. تا زمانی که مرحله حامل در امتداد محور Z به بالا و پایین حرکت می کند، سطح جدیدی از نمونه به صفحه هم کانونی منتقل می شود و سطح جدید نمونه بر روی مانیتور تصویر می شود، همانطور که محور Z ادامه می دهد. حرکت، تصاویر متوالی برش نور از سطوح مختلف نمونه به دست می آید.
میکروسکوپ نوری سنتی از یک منبع نور میدانی استفاده می کند، تصویر هر نقطه روی نمونه با پراش یا پراکندگی نور از نقاط مجاور تداخل پیدا می کند. میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری از یک پرتو لیزر از طریق سوراخ سوزنی روشن استفاده می کند تا یک منبع نور نقطه ای را بر روی نمونه اسکن شده در هر نقطه از صفحه کانونی داخلی، نمونه در نقطه تابش شده، تصویربرداری از سوراخ تشخیص، با تشخیص سوراخ سوزنی تشکیل دهد. پس از نقطه لوله ضرب نور (PMT) یا دستگاه الکتروکوپل شده سرد (cCCD) که نقطه به نقطه یا خط به خط دریافت می شود، یک تصویر فلورسنت به سرعت بر روی صفحه نمایش مانیتور کامپیوتر تشکیل می شود. سوراخ سوزن روشنایی و سوراخ تشخیص نسبت به صفحه کانونی لنز شیئی مزدوج است، نقطه روی صفحه کانونی در همان زمان بر روی سوراخ سوزنی روشنایی و سوراخ سوزنی انتشار متمرکز است، نقطه خارج از صفحه کانونی در تشخیص نخواهد بود. سوراخ سوزنی در تصویربرداری، به طوری که تصویر کانفوکال به دست آمده، مقطع نوری نمونه باشد، بر کاستی های تصویر میکروسکوپ معمولی فازی غلبه کند.
از اصل اساسی، میکروسکوپ کانفوکال لیزری یک میکروسکوپ نوری مدرن است، این میکروسکوپ نوری معمولی از فناوری برای ایجاد پیشرفتهای زیر است.
1. از لیزر به عنوان منبع نور استفاده کنید زیرا تک رنگی لیزر بسیار خوب است، طول موج پرتو منبع نور یکسان است و اساساً انحراف رنگی را از بین می برد.
2. استفاده از فناوری کانفوکال در صفحه کانونی لنز شیئی که در وسط با یک سوراخ کوچک در بافل قرار می گیرد، صفحه کانونی خارج از نور سرگردان مسدود می شود و انحراف کروی را از بین می برد. و بیشتر انحراف رنگی را از بین می برد.
3. میکروسکوپ کانفوکال لیزری با استفاده از فناوری اسکن نقطه ای برای تجزیه نمونه به فضای دو بعدی یا سه بعدی به نقاط بی شمار، با یک پرتو لیزر بسیار کوچک (منبع نور نقطه ای) نقطه به نقطه، تصویربرداری اسکن خط به خط، و سپس از طریق ترکیب میکرو کامپیوتر از یک صفحه کامل یا تصویر سه بعدی. میکروسکوپ نوری سنتی یک منبع نور میدانی تحت تصویربرداری یکباره است، نمونههای موجود در هر نقطه از تصویر در مجاورت نقطه پراش نور و تداخل نور پراکنده خواهند بود. وضوح و دقت این دو تصویر قابل مقایسه نیست.
4. اکتساب و پردازش سیگنال های نوری با کامپیوتر و تقویت سیگنال ها با لوله فتومولتیپلایر
در میکروسکوپ کانفوکال لیزری، کامپیوتر برای مشاهده و ضبط ویدئو جایگزین چشم یا دوربین انسان می شود و تصاویر به دست آمده دیجیتالی می شوند و می توانند در کامپیوتر پردازش شوند تا وضوح تصاویر دوباره بهبود یابد. علاوه بر این، استفاده از لامپ های فوتو ضرب می تواند سیگنال های بسیار ضعیف را تقویت کند و حساسیت را تا حد زیادی بهبود بخشد. در نتیجه استفاده ترکیبی از فناوری های فوق می توان گفت که LSCM پیشرفته ترین میکروسکوپ در جهان است. می توان گفت LSCM ترکیبی از فناوری تولید میکروسکوپ، فناوری فوتوالکتریک، فناوری کامپیوتر **، محصول اجتناب ناپذیر توسعه فناوری مدرن است.
