اصول میکروسکوپ فلورسانس
میکروسکوپ های فلورسانس با میکروسکوپ های نوری معمولی متفاوت هستند. به جای مشاهده نمونه ها در زیر نور منابع نور معمولی، آنها از نور با طول موج معین (معمولاً نور ماوراء بنفش، نور آبی-بنفش) برای تحریک مواد فلورسنت در نمونه ها در زیر میکروسکوپ استفاده می کنند تا آنها را فلورسانس ساطع کنند. بنابراین، منبع نور یک میکروسکوپ فلورسانس به عنوان نور مستقیم عمل نمی کند، بلکه به عنوان یک منبع انرژی است که مواد فلورسنت را در نمونه تحریک می کند. دلیل اینکه ما میتوانیم نمونه را مشاهده کنیم به دلیل روشنایی منبع نور است، اما پدیده فلورسانس پس از اینکه ماده فلورسنت موجود در نمونه، انرژی نور برانگیخته را جذب میکند، ارائه میشود.
مشاهده می شود که ویژگی میکروسکوپ فلورسانس این است که منبع نور آن می تواند مقدار زیادی نور تحریک را در یک محدوده طول موج مشخص تامین کند، به طوری که ماده فلورسنت در نمونه آزمایش شده می تواند نور تحریک را با شدت لازم به دست آورد. در عین حال، میکروسکوپ فلورسانس باید دارای سیستم فیلتر مربوطه باشد.
میکروسکوپ فلورسانس یک ابزار ضروری در هیستوشیمی ایمونوفلورسانس است. از منبع نور فوق ولتاژ بالا، سیستم فیلتر (شامل صفحه فیلتر تحریک و سرکوب)، سیستم نوری و سیستم عکاسی و سایر اجزای اصلی تشکیل شده است. از نور با طول موج معین برای تحریک نمونه برای انتشار فلورسانس استفاده می کند.
راه برانگیختن فلورسانس: با توجه به محدوده طول موج نور می توان آن را به دو نوع تقسیم کرد: روش تحریک UV (با استفاده از روش نور ماوراء بنفش) و روش تحریک BV (با استفاده از نور آبی بنفش). روش تحریک UV از نور نزدیک به فرابنفش کمتر از 400 نانومتر برای تحریک استفاده می کند. در این روش نور تحریک مرئی وجود ندارد، بنابراین فلورسانس مشاهده شده فلورسانس ذاتی رنگ را نشان می دهد و تشخیص فلورسانس خاص روی نمونه از اتوفلورسانس بافت زمینه آسان است.
روش تحریک BV بر اساس 404 نانومتر و 434 نانومتر برای تحریک از نور ماوراء بنفش به نور آبی است. در این روش از نور آبی برای تابش نمونه استفاده می شود، بنابراین فیلتر قطع کننده سیستم مشاهده فلورسانس باید از فیلتری استفاده کند که بتواند نور آبی را به طور کامل مسدود کند و فلورسانس سبز و زرد مورد نیاز را به طور کامل عبور دهد. رنگ های فلورسنت برای سنجش آنتی بادی فلورسنت. حداکثر طول موج جذب نور تحریک نسبتا نزدیک به حداکثر طول موج انتشار فلورسانس است، بنابراین فیلتر مورد استفاده در روش تحریک BV باید از یک فیلتر قطع تیز استفاده کند. این روش می تواند از نور آبی به عنوان نور تحریک استفاده کند، بنابراین راندمان جذب رنگدانه فلورسنت بالاتر است و می توان تصویر روشن تری به دست آورد. عیب آن این است که فلورسانس زیر 500 نانومتر دیده نمی شود و فلورسانس بالای 500 نانومتر کل تصویر را زرد نشان می دهد. در روش آنتی بادی فلورسنت، ویژگی فلوروکروم اغلب با رنگ منحصر به فرد فلوروکروم قضاوت می شود. بنابراین، هنگام بحث در مورد ویژگی ظریف، کاستی های ذکر شده در روش تحریک BV اغلب تأثیر زیادی دارند.
به طور خلاصه، روشنایی میکروسکوپ فلورسانس را می توان با توجه به ساختار کندانسور و طول موج نور تحریک با توجه به سه نقطه زیر در نظر گرفت.
① از منظر الزامات کنتراست تصویر فلورسنت، متمرکز کننده میدان تاریک تحریک UV برای روشنایی استفاده می شود.
② با توجه به روشنایی تصویر، فیلتر تحریک BV بالاترین بازده مشاهده میدان تاریک را دارد.
③مشاهده میدان تاریک فیلتر تحریک UV و روشنایی متمرکز کننده میدان تاریک تحریک BV را می توان بین این دو روش روشنایی در نظر گرفت، اما اولی خواص میدان تاریک قوی تری دارد و تصاویر روشن تری را نمایش می دهد. کنتراست کوچک است. دومی ویژگی های مسیر نور میدان تاریک را حفظ می کند، بنابراین تصویر نمایش داده شده تیره تر است و کنتراست بهبود می یابد. هنگام استفاده از میکروسکوپ فلورسانس، روش روشنایی که به بهترین وجه با نیازهای نمونه مطابقت دارد باید برای مشاهده استفاده شود.
لازم به ذکر است که حتی اگر خازن میدان تاریک تحریک شده با UV با بهترین کنتراست روشن شود، بخشی از نور تحریک ماوراء بنفش شکسته یا پراکنده شده توسط نمونه وارد عدسی شیئی می شود. اتوفلورسانس می تواند پاسخ تصویر را بدتر کند. بنابراین باید از یک فیلتر جاذب UV در جلوی چشمی به عنوان فیلتر قطع کننده استفاده شود.
