اصول میکروسکوپ کانفوکال
میکروسکوپ کانفوکال یک ابزار تصویربرداری با دقت بالا است که در دهه 1980 ظهور و توسعه یافت و یک ابزار تحقیقاتی علمی ضروری برای مطالعه ساختارهای زیر میکرونی است. با توسعه رایانه‌ها، نرم‌افزارهای پردازش تصویر و لیزرها، میکروسکوپ‌های کانفوکال نیز دستخوش پیشرفت زیادی شده‌اند و اکنون به طور گسترده در زمینه‌های زیست‌شناسی، میکروسیستم‌ها و اندازه‌گیری مواد استفاده می‌شوند. میکروسکوپ کانفوکال نوع جدیدی از میکروسکوپ است که اصل هم کانونی، فناوری اسکن و فناوری پردازش گرافیک کامپیوتری را ادغام می کند. مزایای اصلی آن عبارتند از: وضوح جانبی بالا و وضوح محوری بالا، و سرکوب موثر نور سرگردان، با کنتراست بالا.
یک تنظیم معمولی میکروسکوپ کانفوکال عبارت است از قرار دادن دو سوراخ کوچک بر روی صفحه مزدوج صفحه کانونی جسم اندازه گیری شده، که یکی از آنها در مقابل منبع نور و دیگری در مقابل آشکارساز قرار می گیرد، همانطور که در شکل نشان داده شده است. 1. از شکل می توان دریافت که وقتی نمونه اندازه گیری شده در صفحه شبه فوکوس قرار دارد، شدت نور جمع آوری شده توسط انتهای تشخیص بیشترین مقدار را دارد. هنگامی که نمونه اندازه گیری شده در موقعیت خارج از فوکوس قرار دارد، نقطه نوری در انتهای تشخیص منتشر می شود و شدت نور به سرعت کاهش می یابد. بنابراین، فقط نور ساطع شده توسط نقاط در صفحه کانونی می تواند از سوراخ خروجی عبور کند، در حالی که نور ساطع شده از نقاط خارج از صفحه کانونی در صفحه پین هول خروجی تمرکز ندارد و بیشتر آنها نمی توانند از سوراخ مرکزی عبور کنند. بنابراین، نقطه هدف مشاهده در صفحه کانونی روشن به نظر می رسد و نقطه غیر مشاهده به عنوان پس زمینه سیاه به نظر می رسد و کنتراست را افزایش می دهد و تصویر را پاک می کند. در طی فرآیند تصویربرداری، دو سوراخ پین‌هول هم‌فوکال هستند، نقطه کانونی نقطه شناسایی‌شده و صفحه‌ای که نقطه شناسایی‌شده در آن قرار دارد، سطح هم کانونی است.
اندازه سوراخ در آشکارساز در میکروسکوپ کانفوکال نقش مهمی ایفا می کند. این به طور مستقیم بر وضوح و نسبت سیگنال به نویز سیستم تأثیر می گذارد. اگر سوراخ سوزن بیش از حد بزرگ باشد، اثر تشخیص کانفوکال به دست نمی آید، که نه تنها وضوح سیستم را کاهش می دهد، بلکه نور سرگردان بیشتری را معرفی می کند. اگر سوراخ بیش از حد کوچک باشد، کارایی تشخیص را کاهش می دهد و تصویر میکروسکوپی را کاهش می دهد. روشنایی. مطالعات نشان داده است که وقتی قطر سوراخ سوزن با قطر دیسک Airy برابر باشد، الزامات کانفوکال برآورده می شود و راندمان تشخیص به طور قابل توجهی کاهش نمی یابد. از آنجایی که قطر پین هول معمولاً در حد میکرون است، اگر بین نقطه کانونی پرتو لیزر و موقعیت سوراخ سوزن انحراف وجود داشته باشد، اعوجاج سیگنال رخ می دهد. بنابراین، میکروسکوپ های کانفوکال معمولاً از سیستم فوکوس خودکار استفاده می کنند که عملاً زمان اندازه گیری را افزایش می دهد.
از آنجایی که میکروسکوپ اسکن کانفوکال لیزری یک تصویربرداری نقطه ای است، برای به دست آوردن تصویر دو بعدی از جسم، باید از اسکن دو بعدی در جهت x و y استفاده کرد. میکروسکوپ های مختلف از روش های مختلف اسکن استفاده می کنند:
(1) اسکن اشیاء. یعنی خود جسم طبق قانون خاصی حرکت می کند در حالی که پرتو نور بدون تغییر باقی می ماند. مزایا: مسیر نوری پایدار. معایب: یک میز اسکن بزرگ مورد نیاز است، بنابراین سرعت اسکن بسیار محدود است.
(2) یک سیستم اسکن پرتو با استفاده از یک گالوانومتر بازتابی تشکیل می شود. یعنی با کنترل گالوانومتر اسکن، نقطه نور متمرکز به طور منظم به لایه خاصی از جسم منعکس می شود تا اسکن دو بعدی کامل شود. مزیت آن این است که دقت بالایی دارد و اغلب برای اندازه گیری با دقت بالا استفاده می شود. سرعت اسکن نسبت به اسکن شی بهبود یافته است، اما هنوز سریع نیست.
(3) از عنصر انحراف آکوستو-اپتیک برای اسکن استفاده کنید و اسکن با تغییر فرکانس خروجی موج صوتی و سپس تغییر جهت انتقال موج نور محقق می شود. مزیت برجسته آن این است که سرعت اسکن بسیار سریع است. سیستم اسکن توسعه یافته توسط ایالات متحده از یک منحرف کننده آکوستو-اپتیک برای تولید تصاویر ویدیویی در زمان واقعی استفاده می کند. اسکن یک تصویر دو بعدی فقط 1/30 ثانیه طول می کشد و تقریباً به خروجی بلادرنگ می رسد.
(4) اسکن دیسک Nipkow. فرآیند اسکن با چرخاندن دیسک Nipkow و در عین حال ثابت نگه داشتن سایر اجزا تکمیل می شود. می توان آن را در یک زمان تصویربرداری کرد و سرعت آن بسیار سریع است. با این حال، از آنجایی که پرتو تصویربرداری نور خارج از محور است، انحراف خارج از محور لنز باید اصلاح شود و میزان استفاده از انرژی نور بسیار پایین است.
