اصل و ساخت میکروسکوپ فلورسانس
میکروسکوپ فلورسانس از یک منبع نور نقطه ای با راندمان بالا استفاده می کند که طول موج خاصی از نور (مانند نور فرابنفش 3650 اینچ یا نور آبی بنفش 4200 اینچ) را از طریق یک سیستم فیلتر رنگی به عنوان نور تحریک ساطع می کند و مواد فلورسنت موجود در نمونه را تحریک می کند. رنگ های مختلف فلورسانس را منتشر می کند. پس از آن از طریق بزرگنمایی شیء و چشمی مشاهده می شود. به این ترتیب، حتی با فلورسانس ضعیف، به راحتی قابل تشخیص و در زیر زمینه های متضاد قوی است که عمدتاً برای مطالعه ساختار و عملکرد سلول و همچنین ترکیب شیمیایی استفاده می شود. ساختار اصلی یک میکروسکوپ فلورسانس از یک میکروسکوپ نوری معمولی و برخی از لوازم جانبی (مانند منبع نور فلورسنت، فیلتر تحریک، جداکننده پرتو دو رنگ و فیلتر مسدود کننده و غیره) تشکیل شده است. منابع نور فلورسنت - معمولاً از لامپ های جیوه ای با فشار فوق العاده بالا (50-200) استفاده می کنند که می توانند نور با طول موج های مختلف ساطع کنند. با این حال، هر ماده فلورسنت دارای طول موج نور تحریکی است که قویترین فلورسانس را تولید میکند، بنابراین فیلترهای تحریک (معمولاً فیلترهای تحریک ماوراء بنفش، بنفش، آبی و سبز) باید اضافه شوند تا فقط یک طول موج مشخص از نور تحریک عبور کند و روشن شود. نمونه، در حالی که تمام نورهای دیگر را جذب می کند. هر ماده پس از تابش نور برانگیخته، فلورسانس مرئی با طول موج بلندتر از تابش را در مدت زمان بسیار کوتاهی ساطع می کند. فلورسانس دارای ویژگی است و به طور کلی ضعیف تر از نور تحریک است. به منظور مشاهده فلورسانس خاص، باید یک فیلتر مسدود کننده (یا سرکوب کننده) در پشت عدسی شیئی اضافه شود. این دو عملکرد دارد: اول اینکه نور تحریک را جذب کرده و از ورود نور به چشمی جلوگیری می کند تا از ایجاد اختلال در فلورسانس و آسیب به چشم جلوگیری کند. ثانیاً، فلورسانس خاصی را انتخاب می کند و اجازه می دهد تا از آن عبور کند و یک رنگ فلورسانس خاص را نمایش می دهد. هر دو نوع فیلتر باید برای استفاده با هم انتخاب شوند.
دو نوع میکروسکوپ فلورسانس بر اساس مسیر نوری آنها وجود دارد:
1. میکروسکوپ فلورسانس انتقال: منبع نور تحریک از طریق ماده نمونه از طریق کندانسور برای تحریک فلورسانس منتقل می شود. معمولاً از کلکتورهای نور میدان تاریک یا کلکتورهای نور معمولی می توان برای تنظیم بازتابنده برای تبدیل نور تحریک و نور جانبی به نمونه استفاده کرد. این یک میکروسکوپ فلورسانس نسبتا قدیمی است. مزیت آن این است که فلورسانس در بزرگنمایی کم قوی است، در حالی که عیب آن این است که با افزایش بزرگنمایی، فلورسانس ضعیف می شود. بنابراین برای مشاهده نمونه های بزرگتر بهتر است.
2. میکروسکوپ فلورسانس پرتو سقوطی این نوع جدیدی از میکروسکوپ فلورسانس است که در دوران مدرن توسعه یافته است. برخلاف مورد قبلی، نور تحریک از لنز شیئی به سطح نمونه میافتد و از همان عدسی شیئی به عنوان کندانسور روشنایی و عدسی شیئی برای جمعآوری فلورسانس استفاده میکند. یک جداکننده پرتو دو رنگ باید به مسیر نوری اضافه شود که در زاویه 45 درجه نسبت به اورانیوم سبک قرار دارد. نور تحریک به عدسی شیئی منعکس شده و روی نمونه متمرکز می شود. فلورسانس تولید شده توسط نمونه و همچنین نور تحریک منعکس شده از سطح عدسی شیئی و شیشه پوششی به طور همزمان وارد عدسی شیئی شده و به جداکننده پرتو دو رنگی باز می گردد و تحریک و فلورسانس را از هم جدا می کند. سپس تحریک باقیمانده توسط فیلتر مسدود کننده جذب می شود. اگر از فیلترهای تحریک متفاوت / جداکننده پرتو دو رنگ / ترکیب فیلتر مسدود کننده استفاده شود، آنها می توانند نیازهای محصولات مختلف واکنش فلورسنت را برآورده کنند. مزیت این میکروسکوپ فلورسنت این است که میدان دید یکنواخت است، تصویربرداری واضح است و هر چه بزرگنمایی بیشتر باشد، فلورسانس قوی تر است.
