تهیه و مشاهده نمونه های بیولوژیکی برای میکروسکوپ الکترونی

تهیه و مشاهده نمونه های بیولوژیکی برای میکروسکوپ الکترونی

وضوح یک میکروسکوپ به طول موج نور استفاده شده بستگی دارد. میکروسکوپ الکترونی که در سال 1933 ظاهر شد، از یک پرتو الکترونی با طول موج بسیار کوتاهتر از نور مرئی به عنوان منبع نور استفاده می کند، به طوری که وضوحی که می تواند به دست آورد در مقایسه با میکروسکوپ نوری بسیار بهبود یافته است. تفاوت در منابع نور همچنین یک سری تفاوت بین میکروسکوپ های الکترونی و میکروسکوپ های نوری را مشخص می کند.

با توجه به تفاوت در اصول تصویربرداری پرتو الکترونی و روش های مختلف عمل بر روی نمونه ها، میکروسکوپ های الکترونی مدرن به انواع مختلفی تبدیل شده اند. در حال حاضر، رایج ترین آنها میکروسکوپ های الکترونی عبوری و میکروسکوپ های الکترونی روبشی هستند. کل بزرگنمایی اولی می تواند بین 1000-1000000 باشد. کل بزرگنمایی دومی می تواند بین 20 تا 300،{3}} بار تغییر کند. این آزمایش عمدتاً تهیه دو نوع نمونه میکروسکوپ، میکروسکوپ الکترونی عبوری و میکروسکوپ الکترونی روبشی را معرفی می‌کند.

2. تجهیزات
1. باکتری اشریشیا کلی (اشریشیا کلی) مایل.
2. محلول یا معرف آمیل استات، اسید سولفوریک غلیظ، اتانول مطلق، آب استریل، 2% فسفاتنگستات سدیم (pH 6.5-8.0) محلول آبی، 0.3% پلی اتیلن محلول فرمالدئید (محلول در کلروفرم)، سلول های رنگدانه c، استات آمونیوم، پلاسمید pBR322.
3. ابزار یا ظروف دیگر: میکروسکوپ نوری معمولی، مش مسی، قیف چینی، بشر، ظرف، قطره چکان استریل، موچین استریل، پین، اسلاید، تخته شمارش، دستگاه پوشش خلاء، خشک کن نقطه بحرانی و غیره.

3. مراحل عملیات
(1) آماده سازی و مشاهده نمونه برای میکروسکوپ الکترونی عبوری
1. درمان مش فلزی
نمونه برای میکروسکوپ نوری برای مشاهده روی یک لام شیشه ای قرار می گیرد. با این حال، در میکروسکوپ الکترونی عبوری، از آنجایی که الکترون ها نمی توانند به ورقه شیشه نفوذ کنند، مواد مش را می توان تنها به عنوان حامل استفاده کرد که معمولاً شبکه های حامل نامیده می شوند. مش حامل را می توان به دلیل مواد و شکل های مختلف به مشخصات مختلفی تقسیم کرد که در میان آنها رایج ترین مش 200-400 مش (تعداد سوراخ ها) مش مسی است. توری مسی باید قبل از استفاده درمان شود تا کثیفی از بین برود و تمیز بماند، در غیر این صورت بر کیفیت فیلم ساپورت و شفافیت عکس های نمونه تاثیر می گذارد. این آزمایش از یک مش مش مسی 400- استفاده می‌کند که می‌توان آن را به صورت زیر درمان کرد: ابتدا آن را با آمیل استات خیس کنید و چند ساعت سفید کنید، سپس چندین بار با آب مقطر بشویید و سپس آن را در اتانول مطلق خیس کنید. کم آبی بدن اگر بعد از روش‌های فوق، توری مسی همچنان تمیز نیست، می‌توانید آن را به مدت 1 تا 2 دقیقه در اسید سولفوریک غلیظ رقیق (1:1) خیس کنید یا چند دقیقه در محلول NaOH 1 درصد بجوشانید و با مقطر آبکشی کنید. چند بار آب دهید و سپس آن را در اتانول بدون آب ریخته و کنار بگذارید.

2. تهیه غشای نگهدارنده
هنگام مشاهده نمونه ها، تور حامل نیز باید با لایه ای از فیلم بدون ساختار و یکنواخت پوشانده شود، در غیر این صورت نمونه های کوچک از سوراخ های شبکه حامل به بیرون نشت می کنند. این فیلم معمولاً فیلم ساپورت یا فیلم حامل نامیده می شود. لایه پشتیبان باید الکترونی شفاف باشد و ضخامت آن معمولاً باید کمتر از 20 نانومتر باشد. تحت تأثیر پرتو الکترونی، فیلم همچنین باید دارای استحکام مکانیکی خاصی برای حفظ پایداری ساختاری و هدایت حرارتی خوب باشد. علاوه بر این، شبکه پشتیبان باید در میکروسکوپ الکترونی استفاده شود، هیچ ساختار قابل رویتی در زیر آن، هیچ واکنش شیمیایی با نمونه حمل شده و هیچ تداخلی در مشاهده نمونه وجود نداشته باشد. ضخامت آن به طور کلی حدود 15 نانومتر است. فیلم پشتیبان می تواند فیلم پلاستیکی (مانند فیلم کلودیون، فیلم پلی اتیلن فرمالدئید و غیره)، فیلم کربن یا فیلم فلزی (مانند فیلم بریلیوم و غیره) باشد. در شرایط کاری عادی، فیلم پلاستیکی می تواند الزامات را برآورده کند. در میان فیلم‌های پلاستیکی، فیلم کلودیونی نسبتاً آسان تهیه می‌شود، اما استحکام آن به خوبی فیلم پلی‌اتیلن فرمالدئید نیست.