تصویربرداری میکروسکوپی چند فوتونی: تکنیک های متنوع برای تصویربرداری نورون ها در داخل بدن

تصویربرداری میکروسکوپی چند فوتونی: تکنیک های متنوع برای تصویربرداری نورون ها در داخل بدن

در مقایسه با میکروسکوپ فلورسانس میدان گسترده تک فوتونی سنتی، میکروسکوپ چند فوتونی (MPM) عملکردهای برش نوری و تصویربرداری عمیق را دارد. در سال 2019، جروم لکوک و همکاران. فناوری MPM مرتبط را از سه جنبه مورد بحث قرار داد: تصویربرداری نورون در عمق مغز، تصویربرداری نورون عظیم و تصویربرداری نورون با سرعت بالا.

به منظور پیوند فعالیت نورون با رفتار پیچیده، معمولاً لازم است از نورون‌ها در قشر عمیق تصویربرداری شود، که به MPM نیاز دارد تا توانایی تصویربرداری عمیق را داشته باشد. نور تحریک و انتشار به شدت توسط بافت بیولوژیکی پراکنده و جذب می شود که عامل اصلی محدود کننده عمق تصویربرداری MPM است. اگرچه مشکل پراکندگی را می توان با افزایش شدت لیزر حل کرد، اما مشکلات دیگری مانند سوزاندن نمونه، عدم تمرکز و تحریک فلورسنت نزدیک به سطح را به همراه خواهد داشت. بهترین راه برای افزایش عمق تصویربرداری MPM استفاده از طول موج های بلندتر به عنوان نور تحریک است.

علاوه بر این، برای تصویربرداری دو فوتونی (2P)، تحریک فلورسانس خارج از فوکوس و برانگیختگی فلورسانس نزدیک به سطح، دو عامل بزرگ محدودکننده عمق هستند، در حالی که برای تصویربرداری سه فوتونی (3P)، این دو مشکل بسیار کاهش می‌یابد، اما تصویربرداری سه فوتونی به دلیل فلورسانس سطح مقطع جذب گروه بسیار کوچکتر از 2P است، بنابراین برای به دست آوردن سیگنال فلورسانس با شدتی که توسط 2P برانگیخته می شود، مرتبه ای از انرژی پالس بالاتری لازم است. میکروسکوپ عملکردی 3P نسبت به میکروسکوپ ساختاری 3P نیازمندتر است، که به اسکن سریع‌تر برای نمونه‌برداری از فعالیت عصبی در زمان نیاز دارد. انرژی پالس بالاتری برای جمع آوری سیگنال های کافی در زمان ماندگاری هر پیکسل مورد نیاز است.

رفتارهای پیچیده اغلب شامل شبکه های مغزی بزرگ با اتصالات محلی و دوربرد می شود. برای پیوند دادن فعالیت نورون ها با رفتار، لازم است فعالیت نورون های بسیار بزرگ و به طور گسترده ای را به طور همزمان تحت نظر داشته باشید. شبکه عصبی در مغز محرک های دریافتی را در عرض ده ها میلی ثانیه پردازش می کند. برای درک این شبکه عصبی سریع برای مطالعه دینامیک نورون ها، MPM باید توانایی تصویربرداری سریع از نورون ها را داشته باشد. روش های سریع MPM را می توان به تکنیک های اسکن تک پرتو و تکنیک های اسکن چند پرتو تقسیم کرد.

فناوری اسکن تک پرتو، پیمایش بافت عصبی را با سرعت بالا با میدان دید بزرگ (FOV) امکان پذیر می کند.

هنگام استفاده از MPM برای تصویربرداری از نورون‌ها، اسکن با دسترسی تصادفی - یعنی پرتو لیزر به سرعت در هر نقطه انتخاب شده در کل میدان دید اسکن می‌شود - می‌تواند فقط نورون‌های مورد نظر را اسکن کند، که نه تنها از اسکن رشته‌های عصبی بدون برچسب جلوگیری می‌کند. همچنین زمان اسکن پرتو لیزر را بهینه کنید. اسکن با دسترسی تصادفی (شکل 1) را می توان با یک منحرف کننده آکوستو-اپتیک (AOD) به دست آورد، که با اتصال یک مبدل پیزوالکتریک با سیگنال فرکانس رادیویی به یک کریستال مناسب کار می کند. امواج صوتی حاصل یک توری ضریب شکست دوره ای را القا می کنند، پراش زمانی رخ می دهد که پرتو لیزر از یک توری عبور کند. شدت و فرکانس موج صوتی را می توان توسط سیگنال الکتریکی فرکانس رادیویی تنظیم کرد تا شدت و جهت نور پراش شده را تغییر دهد، به طوری که با استفاده از یک AOD می توان اسکن نقطه دلخواه افقی یک بعدی را متوجه شد و می توان سه بعدی را تحقق بخشید. با استفاده از یک جفت AOD ترکیب شده با سایر فناوری های اسکن محوری، اسکن با دسترسی تصادفی. با این حال، این تکنیک به حرکت نمونه بسیار حساس است و مستعد ایجاد مصنوعات حرکتی است. در حال حاضر، اسکن سریع شطرنجی، یعنی اسکن پیشرونده در FOV، به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرد زیرا این الگوریتم می تواند به راحتی مصنوعات حرکت را حل کند.

تصویربرداری دو فوتونی مبتنی بر AOD از نورون‌های L2/3 نئوکورتتیکال در داخل بدن[2]

راه های زیادی برای انجام اسکن سریع شطرنجی وجود دارد، استفاده از آینه لرزان برای اسکن سریع دو بعدی، ترکیب یک آینه لرزان و یک لنز الکتریکی قابل تنظیم برای اسکن سریع سه بعدی، اما لنز الکتریکی قابل تنظیم به دلیل محدودیت در جهت محوری نمی تواند به سرعت فوکوس کند. سوئیچینگ اینرسی مکانیکی، که بر سرعت تصویربرداری تأثیر می گذارد، اکنون می تواند با یک مدولاتور نور فضایی (SLM) جایگزین شود.

همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، فوکوس از راه دور ابزاری برای دستیابی به تصویربرداری سه بعدی است. در ماژول LSU، گالوانومتر اسکن به صورت افقی اسکن می کند و ماژول ASU شامل لنز شیئی L1 و آینه M است و اسکن محوری با تنظیم انجام می شود. موقعیت M. این تکنیک نه تنها می تواند انحراف نوری معرفی شده توسط لنز هدف اصلی L2 را اصلاح کند، بلکه اسکن محوری سریع را نیز فعال می کند. برای به دست آوردن تصویربرداری بیشتر از نورون، FOV را می توان با تنظیم طراحی عدسی شیئی میکروسکوپ بزرگ کرد، اما عدسی شیئی با NA بزرگ و FOV بزرگ معمولا سنگین است و نمی تواند به سرعت برای اسکن محوری سریع حرکت کند، بنابراین سیستم های FOV بزرگ به تله فوکوس متکی هستند. ، SLM و لنزهای موتوری قابل تنظیم.

نمودار شماتیک یک سیستم تصویربرداری دو فوتونی با فوکوس از راه دور[3] فناوری اسکن چند پرتوی می تواند به طور همزمان موقعیت های مختلف بافت عصبی را تصویر کند.

This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>سایت‌های تصویربرداری با فاصله 1-2 میلی‌متر (شکل 3C,D)؛ برای مناطق مجاور، معمولاً از پرتوهای متعدد یک عدسی شیئی برای تصویربرداری استفاده می کند (شکل 3E,F). تکنیک اسکن چند پرتو باید توجه ویژه ای به مشکل تداخل بین پرتوهای تحریک داشته باشد، که می تواند با روش جداسازی منبع پس نور یا روش چندگانه فضا-زمان حل شود. روش جداسازی منبع نور پس از اتصال به استفاده از الگوریتم هایی برای جداسازی پرتوها برای حذف تداخل اشاره دارد. روش مالتی پلکسی زمان-فضا به استفاده همزمان از پرتوهای تحریک چندگانه اشاره دارد، پالس های هر پرتو با تأخیر در زمان است، به طوری که پرتوهای منفرد برانگیخته شده توسط پرتوهای مختلف می توانند به طور موقت از هم جدا شوند. سیگنال فلورسنت نورون های بیشتری را می توان با معرفی پرتوهای بیشتر تصویر کرد، اما پرتوهای متعدد همپوشانی زمان فروپاشی فلورسانس را افزایش می دهد، که توانایی تشخیص منابع سیگنال را محدود می کند. و مالتی پلکس تاثیر منفی بر سرعت کار دستگاه های الکترونیکی دارد. الزامات بالا؛ تعداد زیادی از پرتوها نیز به قدرت لیزر بالاتری نیاز دارند تا نسبت سیگنال به نویز تقریباً یک پرتو را حفظ کنند، که به راحتی می تواند منجر به آسیب بافت شود.

فناوری تصویربرداری منطقه بزرگ
در سال‌های اخیر، توسعه فناوری‌های مختلف MPM دامنه تصویربرداری ما از بافت عصبی را گسترده‌تر کرده است و به ما اجازه می‌دهد تا نورون‌های بیشتری را در اعماق مغز با سرعت بیشتری تصویر کنیم، که تحقیقات علوم اعصاب را بسیار ارتقا داده و ما را قادر می‌سازد تا درک واضح‌تری به دست آوریم. از عملکرد مغز