طبقه بندی میکروسکوپی و اصل کار برای تحقیقات سلولی
میکروسکوپ ابزار اصلی برای مشاهده سلول ها است. با توجه به منابع مختلف نور، می توان آن را به دو دسته تقسیم کرد: میکروسکوپ های نوری و میکروسکوپ های الکترونی. اولی از نور مرئی استفاده می کند (میکروسکوپ های UV از نور ماوراء بنفش استفاده می کنند) به عنوان منبع نور، در حالی که دومی از پرتوهای الکترونی به عنوان منبع نور استفاده می کند.
- میکروسکوپ نوری
(1) میکروسکوپ نوری معمولی
میکروسکوپ‌های بیولوژیکی معمولی از سه بخش تشکیل شده‌اند، یعنی: ① سیستم روشنایی، از جمله منبع نور و کندانسور. ② سیستم بزرگنمایی نوری، متشکل از لنز عینی و چشمی، که بدنه اصلی میکروسکوپ است. به منظور حذف انحراف کروی و انحراف رنگی، هم چشمی و هم هدف ③دستگاه مکانیکی، برای تثبیت مواد و تسهیل مشاهده استفاده می شود (شکل 2-1).
واضح بودن تصویر میکروسکوپ نه تنها با بزرگنمایی مشخص می شود، بلکه به وضوح میکروسکوپ نیز مربوط می شود. وضوح به توانایی میکروسکوپ (یا چشم انسان در فاصله 25 سانتی متری از هدف) برای تشخیص کوچکترین فاصله بین اجسام اشاره دارد. اندازه وضوح توسط طول موج و نسبت دیافراگم نور و ضریب شکست محیط با فرمول بیان می شود:
در فرمول: n=ضریب شکست محیط;=زاویه دیافراگم (زاویه باز شدن نمونه نسبت به دیافراگم عدسی شیئی)، NA=دیافراگم لنز (دیافراگم عددی). زاویه لنز همیشه کمتر از 180 درجه است، بنابراین حداکثر مقدار sina/2 باید کمتر از 1 باشد.
ضریب شکست شیشه ای که برای ساخت لنز نوری استفاده می شود 1.65 تا 1.78 است و ضریب شکست محیط مورد استفاده به شیشه نزدیک تر است، بهتر است. برای لنزهای شیئی خشک، محیط هوا است و نسبت دیافراگم لنز معمولاً 0 است.05 تا 0.95; برای لنزهای روغنی از روغن سدر به عنوان واسطه استفاده می شود و نسبت دیافراگم لنز می تواند نزدیک به 1.5 باشد.
طول موج نور معمولی {{0}}nm است، بنابراین مقدار وضوح میکروسکوپ کمتر از 0.2μm نخواهد بود و وضوح چشم انسان 0.2 میلی متر است، بنابراین حداکثر بزرگنمایی طرح کلی میکروسکوپ معمولاً 1000X است.
(2) میکروسکوپ فلورسانس
برخی از مواد موجود در سلول ها، مانند کلروفیل، پس از تابش اشعه ماوراء بنفش می توانند فلورسانس شوند. برخی از مواد به خودی خود نمی توانند فلورسانس کنند، اما اگر با رنگ های فلورسنت یا آنتی بادی های فلورسنت رنگ آمیزی شوند، هنگام تابش اشعه ماوراء بنفش نیز می توانند فلورسانس کنند و میکروسکوپ فلورسانس (شکل 2-2، 3، 4) یکی از ابزارها است. برای تحقیقات کمی و کیفی در مورد چنین موادی.
میکروسکوپ های فلورسانس و میکروسکوپ های معمولی دارای تفاوت های زیر هستند:
1. روش روشنایی معمولاً epi-illumination است، یعنی منبع نور از طریق عدسی شیئی بر روی نمونه تابیده می شود (شکل 2-3).
2. منبع نور نور ماوراء بنفش است، طول موج کوتاهتر است و وضوح بالاتر از میکروسکوپ های معمولی است.
3. دو فیلتر مخصوص وجود دارد، یکی در جلوی منبع نور برای فیلتر کردن نور مرئی و دیگری بین چشمی و عدسی شیئی برای فیلتر کردن اشعه ماوراء بنفش برای محافظت از چشم استفاده می شود.
(3) میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری
میکروسکوپ اسکن هم کانونی لیزری (میکروسکوپ اسکن کانفوکال لیزری، شکل 2-5، 6) از لیزر به عنوان منبع نور اسکن استفاده می‌کند و تصویربرداری را نقطه به نقطه، خط به خط، سطح به سطح اسکن می‌کند، و مجموعه لیزر اسکن و فلورسانس به اشتراک گذاشته می‌شود. لنز شیئی، و کانون عدسی شیئی است نقطه کانونی لیزر اسکن نیز نقطه شیء تصویربرداری آنی است. از آنجایی که طول موج پرتو لیزر کوتاه و پرتو بسیار نازک است، میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال وضوح بالاتری دارد که تقریباً 3 برابر میکروسکوپ نوری معمولی است. سیستم یک بار متمرکز می شود و اسکن به یک صفحه از نمونه محدود می شود. هنگامی که عمق فوکوس متفاوت است، می توان تصاویر سطوح مختلف عمق نمونه را به دست آورد. این اطلاعات تصویر در کامپیوتر ذخیره می شود. از طریق تحلیل و شبیه سازی کامپیوتری می توان ساختار سه بعدی نمونه سلولی را نمایش داد.
میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال می تواند نه تنها برای مشاهده مورفولوژی سلول، بلکه برای تجزیه و تحلیل کمی اجزای بیوشیمیایی داخل سلولی، آمار چگالی نوری و اندازه گیری مورفولوژی سلول استفاده شود.
(4) میکروسکوپ میدان تاریک
میکروسکوپ میدان تاریک (میکروسکوپ میدان تاریک، شکل 2-7) دارای یک صفحه نور در مرکز کندانسور است، به طوری که نور روشنایی مستقیماً وارد عدسی انسان نمی شود و فقط نور منعکس شده و توسط نمونه منعکس می شود. اجازه ورود به لنز شیئی را دارد، بنابراین پس زمینه میدان دید سیاه است، لبه های اجسام روشن است. با استفاده از این میکروسکوپ، ذراتی به کوچکی 4-200 نانومتر دیده می‌شود و وضوح می‌تواند 50 برابر بیشتر از میکروسکوپ‌های معمولی باشد.
(5) میکروسکوپ کنتراست فاز
میکروسکوپ فازکنتراست (میکروسکوپ فازکنتراست، شکل 2-8، 9) توسط پی. بزرگترین ویژگی این میکروسکوپ این است که می تواند نمونه های رنگ نشده و سلول های زنده را مشاهده کند.
اصل اساسی میکروسکوپ کنتراست فاز تغییر مسیر نوری نور مرئی عبوری از نمونه به اختلاف دامنه است، در نتیجه کنتراست بین ساختارهای مختلف را بهبود می بخشد و ساختارهای مختلف را به وضوح قابل مشاهده می کند. نور پس از عبور از نمونه شکسته شده، از مسیر نوری اولیه منحرف شده و 1/4λ (طول موج) به تاخیر می افتد. تقویت، افزایش یا کاهش دامنه، افزایش کنتراست. از نظر ساختار، میکروسکوپ های کنتراست فاز دارای دو ویژگی خاص هستند که با میکروسکوپ های نوری معمولی متفاوت است:
1. دیافراگم حلقوی بین منبع نور و کندانسور قرار دارد و وظیفه آن این است که نوری که از کندانسور عبور می کند یک مخروط نوری توخالی تشکیل می دهد و روی نمونه متمرکز می شود.
2. صفحه فاز (فاز صفحه حلقوی) یک صفحه فاز پوشیده شده با فلوراید منیزیم را در عدسی شیئی اضافه می کند که می تواند فاز نور مستقیم یا نور پراکنده را 1/4λ به تاخیر بیاندازد. دو نوع وجود دارد:
① صفحه فاز پلاس: نور مستقیم 1/4λ به تاخیر می افتد. پس از ترکیب دو گروه از امواج نور، امواج نور با هم جمع شده و دامنه افزایش می یابد. ساختار نمونه روشن تر از محیط اطراف است و کنتراست روشن (یا کنتراست منفی) ایجاد می کند.
② صفحه فاز B بعلاوه: نور پراش شده 1/4λ به تأخیر می افتد. پس از ترکیب دو مجموعه پرتو، امواج نور کم می‌شوند و دامنه کوچک‌تر می‌شود و کنتراست تاریک (یا کنتراست مثبت) ایجاد می‌کند و ساختار تیره‌تر از محیط اطراف است.
(6) میکروسکوپ پلاریزه
میکروسکوپ پلاریزه برای تشخیص مواد دارای انکسار مضاعف مانند رشته ها، دوک ها، کلاژن، کروموزوم ها و غیره استفاده می شود. تفاوت آن با میکروسکوپ های معمولی این است که در جلوی منبع نور یک پلاریزه کننده (پلاریزه کننده) وجود دارد، به طوری که نور ورودی به میکروسکوپ نور پلاریزه است و یک آنالایزر (پلارایزری که جهت قطبش آن بر قطبش عمود است) وجود دارد. بشکه لنز مرحله این میکروسکوپ قابل چرخش است. هنگامی که یک ماده تک انکساری روی صحنه قرار می گیرد، مهم نیست که صحنه چگونه می چرخد، چون دو قطبش عمودی هستند، نوری در میکروسکوپ دیده نمی شود و نور در میکروسکوپ قابل مشاهده نیست. هنگام ورود به مواد مضاعف، مرحله چرخش می تواند چنین اجسامی را تشخیص دهد زیرا نور هنگام عبور از چنین موادی منحرف می شود.
