کلاس درس تصویربرداری میکروسکوپی 丨 کاربرد میکروسکوپ فلورسانس
میکروسکوپ فلورسانس انعکاس داخلی کل (TIRFM) تکنیکی است که از موج ناپایدار تولید شده توسط پرتو نوری که بین دو محیط ضریب شکست مختلف منتشر میشود، برای بررسی سطح سلولهای زنده نشاندار شده با فلورسنت استفاده میکند. در عمل، هنگامی که یک پرتو لیزر برخوردی با سطح مشترک بین لغزش پوششی و محیط آبی حاوی سلولها مواجه میشود، در زاویه بحرانی (بازتاب داخلی کل) منعکس میشود. از آنجایی که انرژی موج محو شونده با فاصله از لغزش به صورت تصاعدی کاهش مییابد، تنها فلوروفورهایی که در 10 نانومتر از سطح قرار دارند (بین 10 تا 200 نانومتر) توسط موج محرک تحریک میشوند، در حالی که فلوروفورهای دورتر تا حد زیادی تحریک نشدهاند. متأثر، تحت تأثیر، دچار، مبتلا. بنابراین، TIRFM منجر به سطوح سیگنال بالایی از فلوروفورهای واقع در نزدیکی لغزش پوششی میشود که روی یک پسزمینه بسیار تاریک قرار گرفتهاند و نسبت سیگنال به نویز عالی را ارائه میدهند. محدودیت شدید عمق تحریک برای مطالعه مولکولهای منفرد یا غشاء و ترکیب اندامکها در سلولهای چسبنده نزدیک سطح پوششی ایدهآل است (شکل 8 (ه) را ببینید). از آنجایی که تحریک به نواحی نازک نزدیک لغزش محدود میشود، نور سفید کردن و سمیت نوری نیز به این نواحی محدود میشوند و TIRFM را به یکی از مفیدترین روشها برای مشاهده طولانیمدت تبدیل میکند. این تکنیک به ابزاری اساسی برای مطالعه طیف گسترده ای از پدیده ها در زیست شناسی سلولی و مولکولی تبدیل شده است.
دکانولوشن الگوریتمی است که برای مجموعه ای از تصاویر تمام فوکوس که در امتداد محور نوری (Z) به دست می آید، اعمال می شود تا سیگنال فوتون را در پشته ای از تصاویر برای یک صفحه تصویر معین یا چندین صفحه کانونی افزایش دهد. میکروسکوپ ها باید مجهز به درایوهای فوکوس موتوری با دقت بالا باشند تا ثبت تصویر را در فواصل زمانی مشخص بین سطوح کانونی نمونه تضمین کنند. در یک برنامه معمولی (شکل 8 (f) را ببینید)، فرآیند دکانولوشن برای محو کردن و حذف نور خارج از فوکوس از یک صفحه کانونی معین با استفاده از تحریک فلورسانس و گسیل گسترده استفاده میشود. پیچیده ترین کاربرد این است که فرآیند deconvolution را در کل پشته تصویر برای تولید نماهای پیش بینی شده یا مدل های سه بعدی اعمال کنیم. مجموعهای از تصاویر میدان وسیعی که برای دکانولوشن استفاده میشوند، حداکثر تئوری تعداد فوتونهای ساطع شده توسط نمونه را ثبت میکنند. فرآیند دکانولوشن، شدتهای «تار» فوتونهای ساطع شده در بالا و پایین صفحه کانونی را مجدداً به صفحه اصلی توزیع میکند. بنابراین، دکانولوشن تقریباً از تمام شدتهای انتشار موجود استفاده میکند و بودجه نوری بهینه را فراهم میکند، و این روش را به روش انتخابی برای نمونههای بسیار حساس به نور تبدیل میکند.
گونه ای از پدیده انتقال انرژی تشدید در میکروسکوپ فلورسانس، فلورسانس یا انتقال انرژی تشدید فورستر (FRET) برای به دست آوردن اطلاعات کمی زمانی و مکانی در مورد اتصال و تعامل پروتئین ها، لیپیدها، آنزیم ها و اسیدهای نوکلئیک در سلول های زنده استفاده می شود. FRET میتواند از تکنیکهای حالت ثابت یا با زمان حل استفاده کند، اما تصویربرداری FRET با تفکیک زمانی، مزیت نقشهبرداری دقیقتر فواصل اهداکننده-پذیرنده را دارد. برای تصویربرداری FRET می توان از یک میکروسکوپ فلورسانس پهن میدان استاندارد مجهز به فیلترهای تحریک و انتشار مناسب و یک دوربین حساس استفاده کرد. حسگرهای زیستی که یک پروتئین یا پپتید حساس به محیط زیست را بین دو پروتئین فلورسنت قابل استفاده با FRET قرار می دهند، در حال حاضر به طور گسترده در زیست شناسی سلولی استفاده می شوند. این کاوشگرها به آسانی تحت میکروسکوپ فلورسانس میدان وسیع با استفاده از تکنیکهای FRET گسیل حساس همراه با آنالیز نسبتسنجی تصویربرداری میشوند. علاوه بر این، تصویربرداری طیفی و عدم اختلاط خطی با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری میتواند به نظارت بر پدیدههای FRET در حسگرهای زیستی و سایر کاربردهای پروتئین فلورسنت کمک کند.
میکروسکوپ تصویربرداری طول عمر فلورسانس (FLIM) یک تکنیک پیچیده است که قادر است به طور همزمان طول عمر فلورسانس و مکان فضایی یک فلوروفور را در هر مکان از تصویر ثبت کند. این روش مکانیزمی را برای مطالعه پارامترهای محیطی مانند pH، غلظت یونی، قطبیت حلال، برهمکنشهای غیرکووالانسی، ویسکوزیته و کشش اکسیژن در سلولهای زنده فراهم میکند و دادهها را در آرایههای مکانی و زمانی ارائه میکند. اندازهگیریهای FLIM از طول عمر حالت برانگیخته در مقیاس نانوثانیه مستقل از غلظتهای محلی فلوروفور، اثرات سفیدکننده نوری و طول مسیر (ضخامت نمونه) هستند، اما به واکنشهای حالت برانگیخته مانند انتقال انرژی تشدید حساس هستند. در واقع، ترکیب FLIM با FRET با نظارت بر تغییرات طول عمر اهداکنندگان فلورسنت قبل و بعد از انتقال انرژی رزونانسی، یکی از بهترین روشها برای مطالعه این پدیده محسوب میشود.
تحرک (ضریب انتشار عرضی) ماکرومولکولهای نشاندار شده با فلورسنت و فلوروفورهای کوچک را میتوان با بازیابی فلورسانس پس از تکنیک سفیدکننده نوری (FRAP) تعیین کرد. در FRAP، یک ناحیه انتخاب شده بسیار کوچک (به قطر چند میکرومتر) به شدت، معمولاً با لیزر، روشن می شود تا فلوروفور را در آن ناحیه کاملاً سفید کننده نوری ایجاد کند. نتیجه کاهش یا نابودی چشمگیر فلورسانس است. پس از یک پالس فوتوبلیچینگ، سرعت و میزان بازیابی شدت فلورسانس در مناطق سفید شده به عنوان تابعی از زمان در شدت تحریک پایین برای تولید اطلاعات در مورد سینتیک جمعیت مجدد و بازیابی فلوروفور بررسی شد (شکل 9). FRAP معمولاً با استفاده از EGFP یا سایر پروتئین های فلورسنت انجام می شود. تکنیکهای فعالسازی نوری مرتبط بر پایه فلوروفورهای مصنوعی در قفس خاص یا پروتئینهای فلورسنت عملکردی مشابه هستند که میتوانند با پالسهای کوتاه UV یا بنفش فعال شوند. Photoactivation و FRAP می توانند به عنوان تکنیک های مکمل برای تعیین پارامترهای تحرک استفاده شوند.
در تکنیک مربوط به FRAP، که از دست دادن فلورسانس پس از سفید کردن نور (FLIP) نامیده می شود، یک ناحیه فلورسنت مشخص در یک سلول زنده تحت تابش شدید نور سفید مکرر قرار می گیرد. اگر همه فلوروفورها بتوانند در طول دوره زمانی اندازهگیری شده در ناحیهای که فوتوبلیچ میشود پخش شوند، این امر منجر به از دست دادن کامل سیگنال فلورسنت در سراسر سلول میشود. با محاسبه سرعت ناپدید شدن فلورسانس از کل سلول، تحرک انتشاری فلوروفور هدف را می توان تعیین کرد. علاوه بر این، FLIP می تواند به راحتی مکان و ماهیت هر گونه مانع انتشاری بین بخش های جداگانه سلول ها، مانند مانع بین سوما و آکسون یک نورون را شناسایی کند.
طیفسنجی همبستگی فلورسانس (FCS)، که عمدتاً در میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری یا میکروسکوپ چند فوتونی استفاده میشود، روشی است که برای تعیین اطلاعات جنبشی مانند نرخهای واکنش شیمیایی، ضرایب انتشار، تکنیکهای وزن مولکولی، سرعت جریان و تجمع طراحی شده است. در FCS، یک حجم کوچک (تقریباً یک فمتومتر؛ کانون محدود پراش لیزر) با یک پرتو لیزر متمرکز روشن می شود تا نوسانات شدت فلورسانس خودکار ناشی از دینامیک مولکول های فلورسنت را به عنوان تابعی از زمان در حجم اشغال شده توسط فلورسنت ثبت کند. مولکول ها (شکل 10). فلوروفورهای نسبتاً کوچک به سرعت در حجم روشن پخش می شوند و انفجارهای کوتاهی با شدت تصادفی ایجاد می کنند. برعکس، کمپلکسهای بزرگتر (فلوروفورهای متصل به ماکرومولکولها) آهستهتر حرکت میکنند و الگوهای شدت فلورسانس وابسته به زمان طولانیتر و پایدارتری تولید میکنند.
هنگامی که ساختارهای دارای برچسب فلورسنت به طور متراکم بسته بندی می شوند و در مناطق خاصی از سلول های زنده همپوشانی دارند، تجزیه و تحلیل پویایی و توزیع فضایی آنها دشوار است. میکروسکوپ نقطهای فلورسانس (FSM) یک تکنیک سازگار با تقریباً تمام روشهای تصویربرداری است که از غلظتهای بسیار پایین زیر واحدهای برچسبدار فلورسنت بهره میبرد، فلورسانس خارج از فوکوس را کاهش میدهد و دید ساختارهای برچسبگذاری شده و دینامیک آنها را در مناطق ضخیم بهبود میبخشد. FSM ها تنها با برچسب گذاری کسری از کل ساختار مورد نظر پیاده سازی می شوند. از این نظر، FSM شبیه اجرای FCS در کل میدان دید است، اگرچه تاکید بیشتری بر الگوهای مکانی دارد تا تحلیل زمانی کمی. میکروسکوپ نقطه ای فلورسنت به ویژه در تعیین تحرک و تجمع عناصر اسکلت سلولی مانند اکتین و میکروتوبول ها در سلول های بیش فعال مفید است.
میکروسکوپ کاهش انتشار تحریکشده (STED) یک تکنیک با وضوح فوقالعاده نوظهور با وضوح فضایی بسیار فراتر از حد پراش است، با استفاده از نور ضعیفشده حلقهای شکل برای احاطه کردن پرتو کوچکتری از نور تحریک برای به دست آوردن زیر{2}} نانومتر در محور به دقت تصویر. این تکنیک بر تحریک فلوروفورها با پالسهای لیزری هماهنگ و پالسهای STED دایرهای هماهنگ فضایی متکی است که نور ساطع شده را کاهش میدهند و فلورسانس مولکولهای برانگیخته را در اطراف کانون اسکن لیزری سرکوب میکنند. فلورسانس تولید شده در حاشیه لکه سرکوب می شود، اما نه در مرکز نقطه، بنابراین به طور قابل توجهی اندازه نقطه فلورسنت را کاهش می دهد و به تبع آن وضوح را به میزان قابل توجهی افزایش می دهد. ثابت شده است که STED ابزار مفیدی برای تشخیص سلولهای زنده با وضوح بالا است. سایر تکنیکهای با وضوح فوقالعاده نوظهور، مانند میکروسکوپ محلیسازی فعالشده با نور (PALM) و میکروسکوپ روشنایی ساختاری نور (SIM)، نیز در آینده نزدیک به ابزاری اساسی برای تصویربرداری سلولهای زنده تبدیل خواهند شد.
استفاده روزافزون از پروتئینهای فلورسنت کدگذاری شده ژنتیکی و فلوروفورهای مصنوعی پیشرفته برای تصویربرداری سلولهای زنده، دری را به روی روشهای نوری جدید برای نظارت بر دینامیک زمانی و روابط فضایی باز میکند. اکنون میکروسکوپها مجموعهای کامل از ابزارها را برای مشاهده و ثبت دادههای تصویری فرآیندهای سلولی که در طیف وسیعی از مقیاسهای زمانی و با وضوحهای چندگانه رخ میدهند، دارند. رویدادهای کندتر را می توان به راحتی با استفاده از میکروسکوپ هم کانونی اسکن لیزری مشاهده و ثبت کرد، در حالی که رویدادهای جنبشی سریعتر را می توان با استفاده از فناوری دیسک چرخان به دست آورد. علاوه بر این، میکروسکوپ چند فوتونی تصویربرداری عمیق را در بافتهای ضخیم امکانپذیر میسازد و تکنیکهای بازتاب داخلی کل کاوش سطوح غشایی را با دقت کانفوکال ممکن میسازد. روشهای فلورسانس پیشرفته، مانند FRET، FLIM، FRAP، FCS، FSM، SIM، PALM، و STED، میتوانند برای نظارت بر برهمکنشهای پروتئین-پروتئین در وضوحهایی که اغلب بهتر از حد مجاز در حد پراش است، استفاده شوند. با پیشرفت در فناوری فلوروفور، میکروسکوپ و آشکارساز، دنیای وسیع تری «زیر میکروسکوپ» قرار خواهد گرفت.
