دانش مربوط به میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال
اصل اساسی میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال استفاده از یک منبع نور نقطه ای برای تابش نمونه است که یک نقطه کوچک کاملاً مشخص را در صفحه کانونی تشکیل می دهد. فلورسانس ساطع شده از نقطه پس از تابش توسط عدسی شیئی جمع آوری شده و به اسپکتروفتومتر متشکل از یک آینه رنگی دو طرفه در امتداد مسیر تابش اصلی ارسال می شود. اسپکتروفتومتر فلورسانس را مستقیماً به آشکارساز می فرستد. دو سوراخ در جلوی منبع نور و آشکارساز وجود دارد که به ترتیب پینهولهای روشنایی و پینهولهای تشخیص نامیده میشوند. ابعاد هندسی این دو یکسان است، حدود 100-200nm. در مقایسه با نقطه نوری در صفحه کانونی، این دو مزدوج هستند، به این معنی که نقطه نوری از یک سری عدسی می گذرد و در نهایت می تواند به طور همزمان هم روی سوراخ روشنایی و هم روی سوراخ تشخیص تمرکز کند. به این ترتیب، نور از صفحه کانونی می تواند در محدوده سوراخ تشخیص همگرا شود، در حالی که نور پراکنده از بالا یا پایین صفحه کانونی در خارج از سوراخ تشخیص مسدود می شود و نمی توان تصویربرداری کرد. با اسکن نقطه به نقطه نمونه با لیزر، لوله فتومولتیپلایر پس از تشخیص سوراخ سوزن، تصویر هم کانونی متناظر نقطه به نقطه نور را نیز به دست می آورد که به سیگنال دیجیتال تبدیل شده و به کامپیوتر منتقل می شود. در نهایت، یک تصویر هم کانونی واضح از کل سطح کانونی روی صفحه نمایش سنتز می شود.
هر تصویر سطح کانونی در واقع یک مقطع نوری از نمونه است که همیشه ضخامت خاصی دارد که به آن مقطع نازک نوری نیز میگویند. با توجه به این واقعیت که شدت نور در نقطه کانونی بسیار بیشتر از نقطه غیر کانونی است و نور صفحه غیر کانونی توسط سوراخ های پین فیلتر می شود، عمق میدان سیستم کانفوکال تقریباً صفر است. اسکن در امتداد جهت محور Z می تواند به توموگرافی نوری دست یابد و یک برش نوری دو بعدی در نقطه کانونی نمونه مشاهده شده تشکیل دهد. با ترکیب اسکن صفحه XY (صفحه کانونی) با اسکن محور Z (محور نوری)، می توان با انباشته شدن لایه های پیوسته تصاویر دو بعدی و پردازش آنها با نرم افزارهای کامپیوتری تخصصی، تصویری سه بعدی از نمونه به دست آورد.
سوراخ تشخیص و سوراخ سوزن منبع نور همیشه در یک نقطه متمرکز هستند، به طوری که فلورسانس برانگیخته خارج از صفحه تمرکز نمی تواند وارد سوراخ تشخیص شود.
بیان ساده اصل کار میکروسکوپ کانفوکال لیزری این است که از یک لیزر به عنوان منبع نور استفاده می کند و یک دستگاه اسکن لیزری و یک دستگاه فوکوس مزدوج را بر اساس تصویربرداری میکروسکوپ فلورسانس سنتی اضافه می کند. این سیستمی است که توسط یک کامپیوتر برای جمع آوری و پردازش تصویر دیجیتال کنترل می شود.
