مقدمه ای بر میکروسکوپ فلورسانس
میکروسکوپ فلورسانس عبارت است از تابش جسم رنگآمیزی شده با فلورسین با نور با طول موج کوتاه، به طوری که برای تولید فلورسانس با طول موج بلند هیجانزده شود و سپس مشاهده شود. در یک میکروسکوپ فلورسانس، نور تحریک یک طول موج خاص باید از نور روشنایی نمونه انتخاب شود تا فلورسانس ایجاد شود و سپس فلورسانس باید از نور مخلوط نور تحریک و فلورسانس برای مشاهده جدا شود. بنابراین، سیستم فیلتر نقش فوق العاده مهمی در انتخاب یک طول موج خاص دارد. میکروسکوپ های فلورسانس به طور گسترده ای در زیست شناسی، پزشکی و سایر زمینه ها استفاده می شوند.
1. اجزای اصلی میکروسکوپ فلورسانس:
(الف) منبع نور: منبع نور نوری با طول موج های مختلف (از ماوراء بنفش تا مادون قرمز) ساطع می کند. را
(ب) منبع نور فیلتر تحریک: از طریق نور با طول موج خاص که می تواند باعث شود نمونه فلورسانس تولید کند، در حالی که نوری را که برای فلورسانس هیجان انگیز بی فایده است مسدود می کند. را
(C) نمونه های فلورسنت: عموماً با رنگدانه های فلورسنت رنگ آمیزی می شوند. را
(د) فیلتر مسدود کننده: نور تحریکی را که توسط نمونه جذب نمی شود مسدود می کند و به طور انتخابی فلورسانس را منتقل می کند و برخی از طول موج ها به طور انتخابی در فلورسانس منتقل می شوند.
را
2. طبقه بندی میکروسکوپ های فلورسانس:
میکروسکوپ های فلورسانس به طور کلی به دو نوع انتقالی و انتشاری تقسیم می شوند:
آ. نوع انتقال: نور تحریک از پایین جسم مورد بازرسی می آید و کندانسور یک کندانسور میدان تاریک است، به طوری که نور تحریک وارد عدسی شیئی نمی شود، اما فلورسانس وارد عدسی شیئی می شود. در بزرگنمایی کم روشن است، اما در بزرگنمایی زیاد تاریک است. کار در غوطه وری و مرکزیت روغن دشوار است. تعیین محدوده نور در بزرگنمایی های کم به خصوص دشوار است، اما می تواند پس زمینه میدان دید بسیار تاریکی داشته باشد. نوع انتقال برای اشیاء غیر شفاف استفاده نمی شود. را
ب Epi-type: نوع انتقال در حال حاضر تقریبا حذف شده است. اکثر میکروسکوپ های فلورسانس جدید از نوع epi هستند. منبع نور از بالای جسم مورد بازرسی میآید و در مسیر نوری یک تقسیمکننده پرتو وجود دارد، بنابراین برای اجسام شفاف و مات مناسب است. از آنجایی که لنز شیئی به عنوان یک لنز خازنی عمل می کند، نه تنها کار با آن آسان است، بلکه می تواند به روشنایی یکنواخت کل میدان دید از بزرگنمایی کم تا بزرگنمایی بالا دست یابد. را
را
3. اقدامات احتیاطی برای فلوروسکوپی
آ. تابش طولانی مدت نور تحریک باعث تضعیف و خاموش شدن فلورسانس می شود، بنابراین زمان مشاهده را تا حد امکان کوتاه کنید و در صورت عدم مشاهده موقت از یک بافل برای پوشاندن نور تحریک استفاده کنید. را
ب هنگام مشاهده با لنز غوطه ور روغن، از "روغن غیر فلورسنت" استفاده کنید. را
ج فلورسانس تقریباً همیشه ضعیف است و باید در اتاق تاریک انجام شود. را
د بهتر است یک تثبیت کننده ولتاژ در منبع تغذیه نصب شود، در غیر این صورت ولتاژ ناپایدار نه تنها عمر لامپ جیوه را کاهش می دهد، بلکه بر اثر بازرسی میکروسکوپ نیز تأثیر می گذارد. را
را
4. استفاده از میکروسکوپ فلورسانس
1. الزامات آماده سازی برای نمونه های میکروسکوپ فلورسانس
آ. سرسره شیشه ای
ضخامت اسلاید شیشه ای باید بین 0.8 و 1.2 میلی متر باشد. لام خیلی ضخیم از یک طرف نور بیشتری جذب می کند و از طرف دیگر نمی توان نور تحریک را روی نمونه متمرکز کرد. اسلایدها باید صاف، ضخامت یکنواخت و عاری از اتوفلورسانس آشکار باشند. گاهی اوقات از اسلایدهای شیشه ای کوارتز استفاده می شود. را
ب پوشش شیشه ای
ضخامت شیشه پوشش حدود 0.17 میلی متر، صاف است. برای تقویت نور تحریک می توان از شیشه پوششی خشک نیز استفاده کرد که یک شیشه پوششی مخصوص است که با چندین لایه مواد (مانند فلوراید منیزیم) پوشانده شده است که اثرات تداخلی متفاوتی بر نور با طول موج های مختلف دارد که می تواند فلورسانس به آرامی پیش می رود. نور تحریک از آن عبور می کند و نور تحریک بازتابیده نمونه را تحریک می کند. را
ج نمونه
برش های بافت یا سایر نمونه ها نباید خیلی ضخیم باشند. اگر بیش از حد ضخیم باشد، بیشتر نور تحریک در قسمت پایین نمونه مصرف می شود، در حالی که قسمت بالایی که مستقیماً توسط عدسی شیئی مشاهده می شود نمی تواند به طور کامل برانگیخته شود. علاوه بر این، همپوشانی سلولی یا ناخالصی ها پوشانده می شود و بر قضاوت تأثیر می گذارد. را
د عامل نصب
معمولاً از گلیسیرین به عنوان یک عامل نصب استفاده می شود که باید فاقد فلورسانس خودکار، بی رنگ و شفاف باشد و روشنایی فلورسانس در pH 8 روشن تر است.{1}}.5 و به راحتی محو نمی شود. بنابراین معمولاً از مخلوط مساوی گلیسرول و محلول بافر کربنات 0.5/mol/L با pH 9.{6}} تا 9.5 به عنوان عامل نصب استفاده میشود. را
ه. روغن آینه
به طور کلی، هنگام مشاهده نمونه ها با میکروسکوپ های فلورسانس میدان تاریک و اهداف غوطه وری غوطه وری روغن، باید از روغن غوطه ور استفاده شود. بهتر است از روغن مخصوص آینه غیر فلورسنت استفاده شود که گلیسیرین فوق را نیز می توان جایگزین کرد و از پارافین مایع نیز می توان استفاده کرد اما ضریب شکست پایین است که کمی بر کیفیت تصویر تاثیر می گذارد.
