تفاوت میکروسکوپ فلورسانس با میکروسکوپ معمولی

تفاوت میکروسکوپ فلورسانس با میکروسکوپ معمولی

من اخیراً سعی کردم چند بخش یخ زده از موش بسازم و اکنون باید از یک میکروسکوپ فلورسانس استفاده کنم تا ببینم آیا ویروسی که تزریق کردم در ناحیه مورد نظر مغز است یا خیر. برخی از اصول اولیه میکروسکوپ فلورسانس نیاز به مطالعه مختصر دارد و من نیز آنها را در اینجا به اشتراک خواهم گذاشت.

میکروسکوپ فلورسانس از نور ماوراء بنفش به عنوان منبع نور برای روشن کردن جسم مورد آزمایش استفاده می کند و باعث می شود که جسم منبع نوری ساطع کند و سپس جسم را زیر میکروسکوپ مشاهده کند. به طور عمده برای سلول های ایمونوفلورسانس استفاده می شود، از یک منبع نور، سیستم صفحه فیلتر و سیستم نوری برای مشاهده تصویر فلورسانس نمونه از طریق بزرگنمایی چشمی و عدسی شیئی تشکیل شده است. بیایید نگاهی به تفاوت بین این میکروسکوپ فلورسانس و یک میکروسکوپ نوری معمولی بیندازیم.

1. از نظر روش های نورپردازی
روش نورپردازی میکروسکوپ فلورسانس عموماً از روش پرتو سقوطی استفاده می‌کند، به این معنی که منبع نور از طریق عدسی شیئی بر روی نمونه آزمایشی پخش می‌شود.

2. از نظر وضوح
میکروسکوپ فلورسانس از نور ماوراء بنفش به عنوان منبع نور با طول موج نسبتاً کوتاه اما وضوح بالاتر از میکروسکوپ‌های نوری معمولی استفاده می‌کند.

3. تفاوت در فیلتر
یک میکروسکوپ فلورسانس از دو فیلتر مخصوص استفاده می کند، یکی در جلوی منبع نور برای فیلتر کردن نور مرئی و دیگری بین شی و چشمی برای فیلتر کردن نور ماوراء بنفش که می تواند از چشم محافظت کند.

میکروسکوپ فلورسانس نیز نوعی میکروسکوپ نوری است، عمدتاً به این دلیل که طول موج تحریک شده توسط میکروسکوپ فلورسانس کوتاه است که منجر به تفاوت در ساختار و استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ معمولی می شود. اکثر میکروسکوپ های فلورسانس عملکرد خوبی در گرفتن نور ضعیف دارند، بنابراین توانایی تصویربرداری آنها در فلورسانس بسیار ضعیف نیز خوب است. علاوه بر این، با بهبود مستمر میکروسکوپ فلورسانس در سال های اخیر، نویز نیز به طور قابل توجهی کاهش یافته است. بنابراین، میکروسکوپ های فلورسانس بیشتر و بیشتر استفاده می شوند.

دانش مربوط به میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی
اصل اساسی تحریک دو فوتونی این است که در چگالی فوتون بالا، مولکول‌های فلورسنت می‌توانند به طور همزمان دو فوتون با طول موج بلند را جذب کنند و پس از یک دوره کوتاه مدت به اصطلاح حالت برانگیخته، یک فوتون با طول موج کوتاه‌تر ساطع کنند. اثر آن مانند استفاده از فوتونی با طول موج نصف طول موج بلند برای تحریک مولکول های فلورسنت است. تحریک دو فوتونی به چگالی فوتون بالایی نیاز دارد و برای جلوگیری از آسیب رساندن به سلول ها، از لیزر پالس قفل شده با انرژی بالا در میکروسکوپ دو فوتونی استفاده می شود. لیزر ساطع شده توسط این نوع لیزر دارای پیک انرژی بالا و انرژی متوسط ​​کم است که عرض پالس آن تنها 100 فمتوثانیه و فرکانس 80 تا 100 مگاهرتز است. هنگام استفاده از یک هدف با دیافراگم عددی بالا برای فوکوس فوتون های لیزر پالسی، چگالی فوتون در نقطه کانونی شیء بالاترین است و تحریک دو فوتونی فقط در نقطه کانونی شیئی رخ می دهد. بنابراین، یک میکروسکوپ دو فوتونی نیازی به سوراخ های هم کانونی ندارد، که کارایی تشخیص فلورسانس را بهبود می بخشد.

در پدیده های فلورسانس کلی، به دلیل چگالی کم تحریک فوتون، یک مولکول فلورسنت می تواند تنها یک فوتون را به طور همزمان جذب کند و سپس یک فوتون فلورسنت را از طریق انتقال تابش ساطع کند که به آن فلورسانس تک فوتون می گویند. برای فرآیند تحریک فلورسانس با استفاده از لیزر به عنوان منبع نور، پدیده های فلورسانس دو فوتون یا حتی چند فوتونی ممکن است رخ دهد. در این زمان، منبع نور تحریک استفاده شده با شدت بالا است و چگالی فوتون نیاز مولکول های فلورسنت برای جذب دو فوتون را به طور همزمان برآورده می کند. در فرآیند استفاده از لیزر معمولی به عنوان منبع نور تحریک، چگالی فوتون هنوز برای ایجاد پدیده جذب دو فوتون کافی نیست. به طور معمول از لیزرهای پالس فمتوثانیه استفاده می شود و قدرت آنی آنها می تواند به سطح مگاوات برسد. بنابراین، طول موج فلورسانس دو فوتون کوتاه‌تر از برانگیختگی است، که معادل اثری است که توسط تحریک نیمه‌موج تحریک ایجاد می‌شود.