دانش مرتبط با میکروسکوپ فلورسانس
اصل اساسی میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال: یک منبع نور نقطه ای برای تابش نمونه استفاده می شود و یک نقطه نوری کوچک به خوبی مشخص در صفحه کانونی تشکیل می شود. متشکل از اسپلیترها تقسیم کننده پرتو فلورسانس را مستقیماً به آشکارساز می فرستد. در جلوی منبع نور و آشکارساز یک سوراخ وجود دارد که به ترتیب سوراخ روشنایی و پینهول تشخیص نامیده میشوند. اندازه هندسی این دو یکسان است، حدود 100-200nm; نسبت به نقطه نوری در صفحه کانونی، این دو مزدوج هستند، یعنی نقطه نوری از یک سری عدسی عبور می کند و در نهایت می توان همزمان روی سوراخ روشنایی و سوراخ تشخیص تمرکز کرد. به این ترتیب، نور از صفحه کانونی می تواند در محدوده سوراخ تشخیص همگرا شود، در حالی که نور پراکنده از بالا یا پایین صفحه کانونی در خارج از سوراخ تشخیص مسدود می شود و نمی توان تصویربرداری کرد. لیزر نقطه به نقطه نمونه را اسکن می کند و لوله فتومولتیپلایر پس از تشخیص سوراخ سوزن نیز تصویر هم کانونی نقطه به نقطه نور مربوطه را به دست می آورد که به سیگنال دیجیتال تبدیل می شود و به کامپیوتر منتقل می شود و در نهایت به یک تصویر شفاف تجمیع می شود. تصویر هم کانونی از کل صفحه کانونی روی صفحه نمایش.
هر تصویر سطح کانونی در واقع یک مقطع نوری از نمونه است و این مقطع نوری همیشه دارای ضخامت خاصی است که به آن مقطع نازک نوری نیز می گویند. از آنجایی که شدت نور در نقطه کانونی بسیار بیشتر از نقطه غیر کانونی است و نور صفحه غیر کانونی توسط سوراخ سوزنی فیلتر می شود، عمق میدان سیستم هم کانونی تقریباً صفر است و در امتداد Z اسکن می شود. محور می تواند توموگرافی نوری را انجام دهد و یک بخش نوری دو بعدی را در نقطه متمرکز نمونه تشکیل دهد. با ترکیب اسکن صفحه XY (صفحه کانونی) با اسکن محور Z (محور نوری)، تصویر سه بعدی نمونه را می توان با جمع آوری تصاویر دو بعدی از لایه های پیوسته به دست آورد و توسط نرم افزار کامپیوتری ویژه پردازش کرد.
یعنی سوراخ تشخیص و سوراخ سوزن منبع نور همیشه روی یک نقطه متمرکز هستند، به طوری که فلورسانس برانگیخته شده در خارج از صفحه کانونی نمی تواند وارد سوراخ تشخیص شود.
بیان ساده اصل کار لیزر کانفوکال این است که از نور لیزر به عنوان منبع نور استفاده می کند. بر اساس تصویربرداری میکروسکوپ فلورسانس سنتی، یک دستگاه اسکن لیزری و یک دستگاه فوکوس مزدوج را اضافه میکند، و این سیستمی برای جمعآوری و پردازش تصویر دیجیتال از طریق کنترل رایانه است.
