تفاوت بین میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ معمولی

تفاوت بین میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ معمولی

1. به روش نورپردازی نگاه کنید

روش روشنایی میکروسکوپ فلورسانس عموماً از نوع epi است، یعنی منبع نور از طریق عدسی شیئی روی نمونه آزمایش قرار می گیرد.

2. به قطعنامه نگاه کنید

میکروسکوپ های فلورسانس از نور ماوراء بنفش به عنوان منبع نور با طول موج نسبتا کوتاه استفاده می کنند، اما وضوح بالاتر از میکروسکوپ های نوری معمولی است.

3، تفاوت در فیلتر

میکروسکوپ فلورسانس از دو فیلتر مخصوص استفاده می کند که در جلوی منبع نور برای فیلتر کردن نور مرئی استفاده می شود و بین عدسی شیئی و چشمی برای فیلتر کردن نور ماوراء بنفش استفاده می شود که می تواند از چشم انسان محافظت کند.

میکروسکوپ فلورسانس نیز نوعی میکروسکوپ نوری است، عمدتاً به این دلیل که طول موج برانگیخته شده توسط میکروسکوپ فلورسانس کوتاه است، بنابراین این امر منجر به تفاوت در ساختار و استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ معمولی می شود. اکثر میکروسکوپ های فلورسانس عملکرد خوبی در گرفتن نور ضعیف دارند. بنابراین تحت فلورسانس بسیار ضعیف، توانایی تصویربرداری آن نیز خوب است. همراه با بهبود مستمر میکروسکوپ فلورسانس در سال های اخیر، نویز نیز تا حد زیادی کاهش یافته است. بنابراین، بیشتر و بیشتر از میکروسکوپ های فلورسانس استفاده می شود.

آشنایی با میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی

اصل اساسی تحریک دو فوتونی این است: در مورد چگالی فوتون بالا، مولکول های فلورسنت می توانند دو فوتون با طول موج بلند را به طور همزمان جذب کنند و پس از یک عمر بسیار کوتاه به اصطلاح حالت برانگیخته، یک فوتون با طول موج کوتاه ساطع کنند. ; این اثر مانند استفاده از یک فوتون با طول موج نصف طول موج بلند برای تحریک یک مولکول فلورسنت است. تحریک دو فوتونی به چگالی فوتون بالایی نیاز دارد و برای اینکه به سلول ها آسیب نرساند، میکروسکوپ دو فوتونی از لیزرهای پالسی قفل دار با انرژی بالا استفاده می کند. این لیزر نور لیزری را با انرژی پیک بالا و انرژی متوسط ​​کم، با عرض پالس تنها 100 فمتوثانیه و فرکانس 80 تا 100 مگاهرتز ساطع می کند. هنگامی که از یک لنز شیئی با دیافراگم عددی بالا برای فوکوس فوتون‌های لیزر پالسی استفاده می‌شود، چگالی فوتون در نقطه کانونی عدسی شیئی بالاترین است و تحریک دو فوتون فقط در نقطه کانونی عدسی شیئی رخ می‌دهد. بنابراین میکروسکوپ دو فوتونی نیازی به سوراخ کانفوکال ندارد که کارایی تشخیص فلورسانس را بهبود می بخشد.

در پدیده فلورسانس عمومی، به دلیل چگالی کم فوتون نور تحریک، یک مولکول فلورسنت می تواند تنها یک فوتون را به طور همزمان جذب کند و سپس یک فوتون فلورسنت را از طریق انتقال تابش ساطع کند که به آن فلورسانس تک فوتونی می گویند. برای فرآیند تحریک فلورسانس با لیزر به عنوان منبع نور، پدیده فلورسانس دو فوتون یا حتی چند فوتون ممکن است رخ دهد. در این زمان، شدت منبع نور تحریک مورد استفاده زیاد است و چگالی فوتون این نیاز را برآورده می کند که مولکول فلورسنت دو فوتون را همزمان جذب کند. در فرآیند استفاده از لیزر عمومی به عنوان منبع نور تحریک، چگالی فوتون هنوز برای ایجاد جذب دو فوتون کافی نیست. معمولاً از لیزر پالسی فمتوثانیه ای استفاده می شود و توان آنی آن می تواند به حد مگاوات برسد. بنابراین، طول موج فلورسانس دو فوتون کوتاهتر از طول موج نور تحریک است، که معادل اثری است که توسط تحریک طول موج نیمه تحریک ایجاد می شود.

میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی دارای مزایای بسیاری است:

1) نور با طول موج بلند کمتر از نور با طول موج کوتاه تحت تأثیر پراکندگی قرار می گیرد و به راحتی می تواند به نمونه نفوذ کند.

2) مولکول های فلورسنت خارج از صفحه کانونی برانگیخته نمی شوند، به طوری که نور تحریک بیشتری می تواند به صفحه کانونی برسد، به طوری که نور تحریک می تواند به نمونه های عمیق تر نفوذ کند.

3) نور نزدیک به مادون قرمز با طول موج بلند نسبت به نور با طول موج کوتاه کمتر برای سلول ها سمی است.

4) هنگام مشاهده نمونه ها با میکروسکوپ دو فوتونی، فوتوبلیچینگ و سمیت نوری فقط در سطح کانونی وجود دارد. بنابراین، میکروسکوپ دو فوتونی برای مشاهده نمونه های ضخیم نسبت به میکروسکوپ تک فوتونی، برای مشاهده سلول های زنده و یا برای انجام آزمایش های فوتوبلیچینگ نقطه ثابت مناسب تر است.

آشنایی با میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال

اصل اساسی میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال: با استفاده از یک منبع نور نقطه ای برای روشن کردن نمونه، یک نقطه نوری کوچک با یک طرح کلی مشخص بر روی صفحه کانونی تشکیل می شود. از شکاف دهنده پرتو تشکیل شده است. تقسیم کننده پرتو فلورسانس را مستقیماً به آشکارساز می فرستد. در جلوی منبع نور و آشکارساز یک سوراخ وجود دارد که به ترتیب سوراخ روشنایی و پین‌هول تشخیص نامیده می‌شوند. ابعاد هندسی این دو یکسان است، حدود 100-200 نانومتر. نسبت به نقطه نوری در صفحه کانونی، این دو مزدوج هستند، یعنی نقطه نوری از یک سری عدسی عبور می کند و در نهایت می توان همزمان روی سوراخ روشنایی و سوراخ تشخیص تمرکز کرد. به این ترتیب، نور صفحه کانونی را می توان در محدوده سوراخ تشخیص متمرکز کرد، در حالی که نور پراکنده از بالا یا پایین صفحه کانونی از سوراخ تشخیص مسدود می شود و نمی توان تصویربرداری کرد. نمونه با لیزر نقطه به نقطه اسکن می شود و لوله فوتومولتیپلایر پس از تشخیص سوراخ سوزنی نیز تصویر هم کانونی نقطه به نقطه نور متناظر را به دست می آورد که به سیگنال دیجیتال تبدیل شده و به کامپیوتر ارسال می شود و در نهایت روی آن تجمیع می شود. صفحه نمایش به یک تصویر هم کانونی واضح از کل صفحه کانونی تبدیل می شود. .

هر تصویر سطح کانونی در واقع یک مقطع نوری از نمونه است و این مقطع نوری همیشه ضخامت خاصی دارد که به آن برش نوری نیز می‌گویند. از آنجایی که شدت نور در نقطه کانونی بسیار بیشتر از نقطه غیر کانونی است و نور صفحه غیر کانونی توسط سوراخ سوزنی فیلتر می شود، عمق میدان سیستم کانفوکال تقریباً صفر است و در امتداد آن اسکن می شود. محور Z می تواند توموگرافی اپتیکال را انجام دهد و یک بخش نوری دوبعدی Observe را در نقطه متمرکز نمونه تشکیل دهد. با ترکیب اسکن صفحه XY (صفحه کانونی) با اسکن محور Z (محور نوری)، با جمع آوری تصاویر دو بعدی از لایه های متوالی و پردازش توسط نرم افزارهای کامپیوتری مخصوص، می توان تصویر سه بعدی از نمونه را به دست آورد.

یعنی سوراخ تشخیص و سوراخ سوزن منبع نور همیشه روی یک نقطه متمرکز هستند، به طوری که فلورسانس برانگیخته شده در خارج از صفحه فوکوس نمی تواند وارد سوراخ تشخیص شود.

بیان ساده اصل کار لیزر کانفوکال این است که از یک لیزر به عنوان منبع نور استفاده می کند و بر اساس تصویربرداری میکروسکوپ فلورسانس سنتی، یک دستگاه اسکن لیزری و یک دستگاه فوکوس مزدوج متصل می شود و تصویر دیجیتالی به دست می آید و پردازش می شود. سیستم توسط کامپیوتر کنترل می شود.