تفاوت بین میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ معمولی
من اخیرا سعی کردم چند بخش یخ زده از موش درست کنم. در مرحله بعد، من از یک میکروسکوپ فلورسانس استفاده می کنم تا ببینم آیا ویروسی که تزریق کردم در ناحیه مغز مورد نظر من است یا خیر. برخی از اصول اولیه میکروسکوپ فلورسانس باید به طور خلاصه یاد بگیرند و من آنها را در اینجا به اشتراک می گذارم.
میکروسکوپ های فلورسانس از نور ماوراء بنفش به عنوان منبع نور برای روشن کردن جسم مورد بازرسی استفاده می کنند و باعث می شود که جسم نور ساطع کند و سپس جسم را زیر میکروسکوپ مشاهده می کند. این عمدتا برای سلول های ایمونوفلورسانس استفاده می شود. این عمدتا از یک منبع نور، یک سیستم صفحه فیلتر و یک سیستم نوری تشکیل شده است. تصویر فلورسنت نمونه از طریق بزرگنمایی چشمی و عدسی شیئی مشاهده می شود. بیایید نگاهی به تفاوت بین یک میکروسکوپ فلورسانس و یک میکروسکوپ نوری معمولی بیندازیم.
1. به روش نورپردازی نگاه کنید
روش روشنایی میکروسکوپ فلورسانس عموماً اپی روشنایی است، به این معنی که منبع نور از طریق عدسی شیئی بر روی نمونه آزمایش قرار می گیرد.
2. به قطعنامه نگاه کنید
میکروسکوپهای فلورسانس از نور فرابنفش به عنوان منبع نور استفاده میکنند که طول موج کوتاهتر اما وضوح بالاتری نسبت به میکروسکوپهای نوری معمولی دارد.
3. تفاوت در فیلترها
میکروسکوپ های فلورسانس از دو فیلتر مخصوص استفاده می کنند، یکی در جلوی منبع نور برای فیلتر کردن نور مرئی و دیگری بین عدسی شیئی و چشمی برای فیلتر کردن اشعه ماوراء بنفش استفاده می شود که می تواند از چشم انسان محافظت کند.
میکروسکوپ فلورسانس نیز نوعی میکروسکوپ نوری است. دلیل اصلی این است که طول موج تحریک شده توسط میکروسکوپ فلورسانس کوتاه است، بنابراین این امر منجر به تفاوت در ساختار و استفاده بین میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ معمولی می شود. اکثر میکروسکوپ های فلورسانس عملکرد خوبی در گرفتن نور ضعیف دارند. بنابراین توانایی تصویربرداری آن تحت فلورسانس بسیار ضعیف نیز خوب است. همراه با بهبود مستمر میکروسکوپ های فلورسانس در سال های اخیر، نویز نیز تا حد زیادی کاهش یافته است. بنابراین، بیشتر و بیشتر از میکروسکوپ های فلورسانس استفاده می شود.
دانش در مورد میکروسکوپ فلورسانس دو فوتون
اصل اساسی تحریک دو فوتونی این است: تحت شرایط چگالی فوتون بالا، مولکول های فلورسنت می توانند دو فوتون با طول موج بلند را به طور همزمان جذب کنند و پس از یک عمر کوتاه به اصطلاح حالت برانگیخته، فوتونی با طول موج کوتاهتر ساطع کنند. . این اثر مانند استفاده از یک فوتون با طول موج نصف طول موج بلند برای تحریک مولکول های فلورسنت است. تحریک دو فوتونی به چگالی فوتون بالایی نیاز دارد. برای اینکه به سلولها آسیب نرسانند، میکروسکوپهای دو فوتونی از لیزرهای پالس قفل شده با انرژی بالا استفاده میکنند. این لیزر نور لیزری را با انرژی پیک بالا و انرژی متوسط کم، با عرض پالس تنها 100 فمتوثانیه و فرکانس 80 تا 100 مگاهرتز ساطع می کند. هنگام استفاده از یک لنز شیئی با دیافراگم عددی بالا برای فوکوس فوتون های لیزر پالسی، چگالی فوتون در کانون عدسی شیئی بالاترین میزان است. تحریک دو فوتونی فقط در کانون عدسی شیئی رخ می دهد، بنابراین میکروسکوپ دو فوتونی نیازی به سوراخ هم کانونی ندارد، که کارایی تشخیص فلورسانس را بهبود می بخشد.
در پدیده فلورسانس عمومی، به دلیل چگالی کم فوتون نور تحریک، یک مولکول فلورسنت می تواند تنها یک فوتون را به طور همزمان جذب کند و سپس یک فوتون فلورسانس را از طریق انتقال تابشی ساطع کند. این فلورسانس تک فوتونی است. برای فرآیند تحریک فلورسانس با استفاده از لیزر به عنوان منبع نور، پدیده های فلورسانس دو فوتون یا حتی چند فوتون ممکن است رخ دهد. در این حالت، شدت منبع نور تحریک استفاده شده زیاد است و چگالی فوتون نیاز مولکول های فلورسنت برای جذب همزمان دو فوتون را برآورده می کند. در فرآیند استفاده از لیزرهای معمولی به عنوان منابع نور تحریک، چگالی فوتون هنوز برای ایجاد جذب دو فوتون کافی نیست. لیزرهای پالس فمتوثانیه معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند و قدرت آنی آنها می تواند به سطح مگاوات برسد. بنابراین، طول موج فلورسانس دو فوتون کوتاهتر از طول موج نور تحریک است، که معادل اثری است که توسط تحریک طول موج نیمه تحریک ایجاد می شود.
