مقایسه میکروسکوپ کانفوکال و میکروسکوپ نوری معمولی

مقایسه میکروسکوپ کانفوکال و میکروسکوپ نوری معمولی

میکروسکوپ نوری عمومی
میکروسکوپ بیولوژیکی عمومی از سه بخش تشکیل شده است، یعنی: ① سیستم روشنایی، از جمله منبع نور و کندانسور. ② سیستم تقویت نوری، که از عدسی شیئی و چشمی تشکیل شده است، بدنه اصلی میکروسکوپ است. به منظور حذف انحراف کروی و انحراف رنگی، هر دو عدسی چشمی و شیئی از گروه‌های لنز پیچیده تشکیل شده‌اند. (3) دستگاه مکانیکی، مورد استفاده برای تثبیت مواد و مشاهده راحت.

واضح بودن یا نبودن تصویر میکروسکوپ نه تنها به بزرگنمایی، بلکه به وضوح میکروسکوپ نیز بستگی دارد. وضوح به توانایی میکروسکوپ (یا مکانی که چشم انسان در فاصله 25 سانتی متری از هدف قرار دارد) برای تشخیص فاصله کوچک جسم zui اشاره دارد. وضوح به طول موج نور، نسبت دیافراگم و ضریب شکست محیط بستگی دارد که با فرمول بیان می شود:
R=0.61λ /N．A. ن.ا.سین /2
کجا: n= ضریب شکست محیط; زاویه آینه=(زاویه باز شدن نمونه به دیافراگم لنز)، و دیافراگم عددی NA=. زاویه آینه همیشه کمتر از 180 است؟ بنابراین مقدار zui sina/2 باید کمتر از 1 باشد.

ضریب شکست شیشه ای که برای ساخت عدسی های نوری استفاده می شود 1.65 ~ 1.78 است و ضریب شکست محیط مورد استفاده به شیشه نزدیک تر است، بهتر است. برای لنز شیئی خشک، محیط هوا است و نسبت دیافراگم معمولاً 0 است.05 ~ 0.95; لنز روغنی از آسفالت معطر به عنوان واسطه استفاده می کند و نرخ باز شدن لنز می تواند نزدیک به 1.5 باشد.

طول موج نور معمولی 400~700 نانومتر است، بنابراین وضوح میکروسکوپ کمتر از 0.2 میکرومتر نیست و وضوح چشم انسان 0.2 میلی متر است، بنابراین بزرگنمایی بزرگ zui طراحی شده توسط میکروسکوپ عمومی معمولا 1000X x است.

چرا به میکروسکوپ کانفوکال نیاز دارید؟
1. میکروسکوپ نوری با تلاش و بهبود پیشینیان بزرگ ما کامل شده است. در واقع میکروسکوپ های معمولی می توانند تصاویر میکروسکوپی زیبایی را به سادگی و به سرعت در اختیار ما قرار دهند. با این حال، رویدادی که نوآوری انقلابی را در این دنیای تقریباً کامل میکروسکوپ به ارمغان آورد، اتفاق افتاد که اختراع "میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری" است. این میکروسکوپ جدید با اتخاذ یک سیستم نوری که فقط اطلاعات تصویر را در صفحه ای که فوکوس در آن متمرکز شده است استخراج می کند و در حین تغییر فوکوس، اطلاعات به دست آمده را در حافظه تصویر بازیابی می کند، به طوری که یک تصویر واضح با اطلاعات کامل سه بعدی می توان به دست آورد. با این روش، اطلاعاتی در مورد شکل سطح که توسط میکروسکوپ های معمولی قابل تایید نیست، به سادگی بدست می آید. علاوه بر این، برای میکروسکوپ های نوری معمولی، «بهبود وضوح» و «تعمیق عمق فوکوس» شرایط متناقضی هستند، به خصوص در بزرگنمایی بالا، اما برای میکروسکوپ های کانفوکال، این مشکل حل می شود.

2. مزایای سیستم نوری کانفوکال
سیستم نوری هم کانونی نقطه نمونه را روشن می کند و نور منعکس شده نیز توسط گیرنده های نقطه ای دریافت می شود. هنگامی که نمونه در موقعیت فوکوس قرار می گیرد، تقریباً تمام نور بازتاب شده می تواند به گیرنده نور برسد، اما زمانی که نمونه از فوکوس منحرف شود، نور منعکس شده نمی تواند به گیرنده نور برسد. یعنی در سیستم اپتیکال کانفوکال تنها تصویری که با فوکوس منطبق است خروجی می‌شود و نور پراکنده فاکولا و بیهوده محافظت می‌شود.

3. چرا از لیزر استفاده کنیم؟
در سیستم نوری کانفوکال، نمونه روشن می شود و نور منعکس شده نیز توسط گیرنده نوری نقطه ای دریافت می شود. بنابراین، منبع نور نقطه ای ضروری می شود. لیزر متعلق به یک منبع نور بسیار نقطه ای است. در بیشتر موارد، منبع نور میکروسکوپ کانفوکال از منبع نور لیزر استفاده می کند. علاوه بر این، ویژگی های لیزر مانند تک رنگ بودن، جهت دهی و شکل عالی پرتو نیز از دلایل مهم استفاده گسترده از آن است.

4. مشاهده زمان واقعی بر اساس اسکن با سرعت بالا امکان پذیر می شود.
در اسکن لیزری، منفجر کننده نوری آکوستیک (عنصر اصلی AO) در جهت افقی و آینه سروو گالوانو در جهت عمودی استفاده می شود. از آنجایی که هیچ بخش لرزش مکانیکی در واحد انحراف نوری صوتی وجود ندارد، می تواند با سرعت بالا اسکن کند و امکان مشاهده در زمان واقعی بر روی صفحه مانیتورینگ وجود دارد. سرعت بالای این دوربین پروژه بسیار مهمی است که به طور مستقیم بر سرعت فوکوس و بازیابی موقعیت تاثیر می گذارد.
　

5. رابطه بین موقعیت فوکوس و روشنایی
در سیستم نوری کانفوکال، زمانی که نمونه به درستی در موقعیت فوکوس قرار گیرد، روشنایی زیاد است و قبل و بعد از آن، روشنایی آن به شدت کاهش می یابد (خط ثابت در شکل 4). این گزینش پذیری حساس صفحه کانونی نیز اصل اندازه گیری جهت ارتفاع میکروسکوپ کانفوکال و گسترش عمق کانونی است. در مقابل، میکروسکوپ نوری معمولی تغییر روشنایی واضحی قبل و بعد از موقعیت فوکوس ندارد (خط نقطه چین در شکل 4).

6. کنتراست بالا و وضوح بالا
در میکروسکوپ نوری عمومی، نور بازتابی که از فوکوس منحرف می‌شود، تداخل پیدا می‌کند و با قسمت تصویربرداری فوکوس همپوشانی پیدا می‌کند و در نتیجه کنتراست تصویر را کاهش می‌دهد. در مقابل، در سیستم نوری کانفوکال، نور پراکنده خارج از فوکوس و نور پراکنده در داخل لنز شیئی تقریباً به طور کامل حذف می شوند، بنابراین می توان تصویری با کنتراست بسیار بالا به دست آورد. علاوه بر این، چون نور دوبار از عدسی شیئی عبور می کند، ابتدا تصویر نقطه ای شارپ می شود و وضوح میکروسکوپ نیز بهبود می یابد.

7. تابع محلی سازی نوری
در سیستم نوری کانفوکال، نور بازتابیده شده در قسمتی غیر از نقطه کانونی توسط ریز منافذ محافظت می شود. بنابراین، هنگام مشاهده یک نمونه سه بعدی، تصویری مانند تصویری که پس از برش نمونه با فوکوس ایجاد می شود، تشکیل می شود (شکل 5). این اثر محلی سازی نوری نامیده می شود که به یکی از تخصص های سیستم نوری کانفوکال تعلق دارد.

8. تمرکز بر عملکرد حافظه متحرک
به اصطلاح نور منعکس شده در خارج از کانون توسط ریز منافذ محافظت می شود. از طرفی می توان در نظر گرفت که تمام نقاط روی تصویر که توسط سیستم نوری کانفوکال تشکیل شده اند با فوکوس منطبق هستند. بنابراین، اگر نمونه سه بعدی در جهت محور Z (محور نوری) حرکت داده شود، تصویر انباشته شده و در حافظه ذخیره می شود و zui در نهایت تصویری را که از همزمانی کل نمونه و فوکوس تشکیل شده است، دریافت می کند. . به این ترتیب تابع عمق بی نهایت فوکوس را تابع حافظه موبایل می نامند.

9. عملکرد اندازه گیری شکل سطح
در تابع حرکت فوکوس، شکل سطح نمونه را می توان به صورت غیر تماسی با افزودن یک حلقه ثبت ارتفاع اندازه گیری کرد. بر اساس این تابع، می توان مختصات محور Z را که از مقدار روشنایی زیاد zui در هر پیکسل تشکیل می شود، ثبت کرد و بر اساس این اطلاعات، اطلاعات مربوط به شکل سطح نمونه را به دست آورد.
　

10. عملکرد اندازه گیری میکرو اندازه با دقت بالا
واحد دریافت نور از یک سنسور تصویربرداری CCD یک بعدی استفاده می کند، بنابراین می تواند تحت تأثیر شیب اسکن دستگاه اسکن قرار نگیرد، به طوری که اندازه گیری با دقت بالا می تواند تکمیل شود. علاوه بر این، از آنجایی که عملکرد حافظه متحرک فوکوس با عمق فوکوس قابل تنظیم به طور همزمان پذیرفته می شود، خطای اندازه گیری ناشی از تغییر فوکوس را می توان حذف کرد.

11. تجزیه و تحلیل تصویر سه بعدی
با استفاده از تابع اندازه گیری شکل سطح می توان به راحتی تصویر سه بعدی سطح نمونه را ساخت. نه تنها این، بلکه انواع مختلفی از تجزیه و تحلیل را نیز می توان انجام داد، مانند: اندازه گیری زبری سطح، مساحت، حجم، مساحت سطح، دایره، شعاع، طول zui، محیط، مرکز ثقل، تصویر توموگرافی، تبدیل FFT، خط. اندازه گیری عرض و غیره

میکروسکوپ اسکن کانفوکال لیزری را می توان نه تنها برای مشاهده مورفولوژی سلول، بلکه برای تجزیه و تحلیل کمی اجزای بیوشیمیایی در سلول ها، آمار چگالی نوری و اندازه گیری مورفولوژی سلول استفاده کرد.