دانش کاری میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال
اصل اساسی میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال: از یک منبع نور نقطه ای برای روشن کردن نمونه استفاده کنید تا یک نقطه نوری کوچک و کاملاً مشخص در صفحه کانونی ایجاد کنید. فلورسانس ساطع شده از نقطه پس از روشن شدن توسط عدسی شیئی جمع آوری شده و در امتداد مسیر نور روشنایی اصلی به آینه دو رنگی باز می گردد. یک تقسیم کننده پرتو را تشکیل می دهند. طیف سنج فلورسانس را مستقیماً به آشکارساز می فرستد. یک سوراخ در جلوی منبع نور و آشکارساز وجود دارد که به ترتیب به آنها سوراخ روشنایی و پینهول تشخیص میگویند. ابعاد هندسی این دو یکسان است، حدود 100-200nm. نسبت به نقطه نور در صفحه کانونی، این دو مزدوج هستند، یعنی نقطه نوری از یک سری عدسی عبور می کند و در نهایت می تواند همزمان روی سوراخ روشنایی و سوراخ تشخیص متمرکز شود. به این ترتیب، نور صفحه کانونی را می توان در محدوده سوراخ تشخیص متمرکز کرد، در حالی که نور پراکنده از بالا یا پایین صفحه کانونی در خارج از سوراخ تشخیص مسدود می شود و نمی توان تصویربرداری کرد. نمونه نقطه به نقطه با لیزر اسکن می شود و لوله فوتو ضربدر پشت سوراخ تشخیص نیز تصویر هم کانونی نقطه به نقطه نور متناظر را به دست می آورد که به سیگنال دیجیتال تبدیل شده و به کامپیوتر منتقل می شود و در نهایت روی آن تجمیع می شود. صفحه نمایش به یک تصویر هم کانونی واضح از کل صفحه کانونی تبدیل می شود. .
هر تصویر سطح کانونی در واقع یک مقطع نوری از نمونه است. این مقطع نوری همیشه ضخامت خاصی دارد و به آن مقطع نازک نوری نیز می گویند. از آنجایی که شدت نور در فوکوس بسیار بیشتر از شدت نور در غیر فوکوس است و نور صفحه غیر کانونی توسط سوراخ سوراخ فیلتر می شود، عمق میدان سیستم کانفوکال تقریباً صفر است. اسکن در امتداد جهت محور Z می تواند توموگرافی اپتیکال را انجام دهد و قسمت مورد نظر اپتیکال را در نقطه متمرکز نمونه مشاهده کنید. با ترکیب اسکن سطح XY (صفحه کانونی) با اسکن محور Z (محور نوری)، با انباشته شدن سطوح پیوسته تصاویر دو بعدی و پردازش آنها با نرم افزارهای تخصصی کامپیوتری، می توان تصویری سه بعدی از نمونه به دست آورد.
یعنی سوراخ تشخیص و سوراخ سوزن منبع نور همیشه روی یک نقطه متمرکز هستند، به طوری که فلورسانس برانگیخته خارج از صفحه فوکوس نمی تواند وارد سوراخ تشخیص شود.
بیان ساده اصل کار لیزر کانفوکال این است که از لیزر به عنوان منبع نور استفاده می کند. بر اساس تصویربرداری میکروسکوپ فلورسانس سنتی، یک دستگاه اسکن لیزری و یک دستگاه فوکوس مزدوج اضافه شده است و سیستم توسط یک کامپیوتر برای جمعآوری و پردازش تصاویر دیجیتال کنترل میشود.
