مروری بر چندین تکنیک میکروسکوپی با وضوح فوق العاده
برای میکروسکوپ نوری معمولی، پراش نور وضوح تصویربرداری را تا حدود 250 نانومتر محدود می‌کند. امروزه، تکنیک‌های با وضوح فوق‌العاده می‌توانند این را تا بیش از 10 ضریب بهبود بخشند. این تکنیک عمدتاً از طریق سه روش به دست می‌آید: میکروسکوپ محلی‌سازی تک مولکولی، از جمله میکروسکوپ محلی‌سازی حساس به نور (PALM) و میکروسکوپ بازسازی نوری تصادفی (STORM). میکروسکوپ روشنایی ساخت یافته (SIM)؛ و میکروسکوپ کاهش انتشار تحریک شده (STED). نحوه انتخاب فناوری با وضوح فوق العاده چیزی است که همه به آن اهمیت می دهند. متیو استریسی، محقق فوق دکتری در دانشگاه آکسفورد، بریتانیا، می گوید: متأسفانه، هیچ اصول ساده ای برای تصمیم گیری در مورد استفاده از روش وجود ندارد. "هر کدام مزایا و معایب خود را دارند." البته دانشمندان همچنین در حال بررسی چگونگی انتخاب روش مناسب برای یک پروژه خاص هستند. در زمینه تصویربرداری زیستی، عوامل کلیدی که باید در نظر گرفته شوند عبارتند از: وضوح مکانی و زمانی، حساسیت به آسیب نوری، ظرفیت برچسب‌گذاری، ضخامت نمونه، و فلورسانس پس‌زمینه یا فلورسانس اتولوگ سلولی. چگونه کار می کند میکروسکوپ های مختلف با وضوح فوق العاده به روش های مختلفی کار می کنند. در مورد PALM و STORM، تنها بخش کوچکی از نشانگرهای فلورسنت در یک لحظه معین برانگیخته یا فعال می شوند و محلی سازی مستقل آنها را با دقت بالا امکان پذیر می کند. انجام این فرآیند با تمام برچسب های فلورسنت منجر به یک تصویر با وضوح فوق العاده می شود. استفان هل، یکی از برندگان جایزه نوبل شیمی در سال 2014 و مدیر مؤسسه شیمی بیوفیزیکی ماکس پلانک، می گوید: «راه اندازی سیستم PALM/STORM نسبتاً آسان است، اما اعمال آن دشوار است، زیرا فلورسنت گروه باید توانایی فعال‌سازی نوری داشته باشد. محدودیت‌ها نقطه ضعف این است که آنها نیاز به شناسایی یک مولکول فلورسنت در بافت سلول دارند و نسبت به STED قابل اعتمادتر هستند. STED از یک پالس لیزر برای تحریک فلوروفور و یک لیزر حلقه‌ای شکل برای خاموش کردن فلوروفور استفاده می‌کند و تنها فلورسانس متوسط نانومتری را برای وضوح فوق‌العاده باقی می‌گذارد. اسکن کل نمونه یک تصویر تولید می کند. Hell توضیح داد: "مزیت STED این است که یک فناوری دکمه ای است." "این مانند یک میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال استاندارد کار می کند." همچنین می تواند سلول های زنده را با استفاده از فلوروفورهایی مانند پروتئین های فلورسنت سبز یا زرد و رنگ های مشتق شده از رودامین تصویربرداری کند. مقایسه پارامتری اگرچه همه تکنیک‌های با وضوح فوق‌العاده از نظر وضوح از میکروسکوپ نوری معمولی پیشی می‌گیرند، اما با یکدیگر متفاوت هستند. سیم کارت وضوح تصویر را تقریبا دو برابر می کند و به حدود 100 نانومتر می رساند. PALM و STORM می توانند اهداف 15 نانومتری را حل کنند. به گفته Hell، STED وضوح فضایی 30 نانومتر در سلول‌های زنده و 15 نانومتر در سلول‌های ثابت ارائه می‌کند. وقتی صحبت از برنامه های خاص می شود، باید نسبت سیگنال به نویز را نیز در نظر بگیریم. در برخی موارد، وضوح کمتر اما SNR بالاتر ممکن است منجر به تصویر بهتری نسبت به عکس آن شود (رزولیشن بالاتر اما SNR کمتر). سرعت گرفتن تصویر نیز به ویژه برای سلول های زنده بسیار مهم است. استریسی گفت: «همه تکنیک‌های با وضوح فوق‌العاده کندتر از تکنیک‌های تصویربرداری فلورسانس معمولی هستند. PALM/STORM کندترین است، برای به دست آوردن یک تصویر به ده ها هزار فریم نیاز دارد، سیم کارت به ده ها فریم نیاز دارد، و STED یک فناوری اسکن است، بنابراین سرعت اکتساب به اندازه میدان دید بستگی دارد. علاوه بر سلول‌های زنده یا سلول‌های تصویربرداری ثابت، برخی از دانشمندان می‌خواهند نحوه حرکت اجسام را نیز درک کنند. استریسی به درک پویایی سیستم های بیولوژیکی در سلول های زنده علاقه مند است، نه فقط تصاویر ایستا. او PALM را با ردیابی تک ذره ترکیب می کند تا پویایی سلول های زنده را تجزیه و تحلیل کند. به این ترتیب، او می‌تواند مستقیماً مولکول‌های نشانگر را در حین انجام عملکردشان ردیابی کند. با این حال، او معتقد است که سیم کارت برای مطالعه این فرآیندهای دینامیکی در سطح مولکولی مناسب نیست، اما به دلیل سرعت اکتساب سریع آن، به ویژه برای مشاهده دینامیک ساختارهای بزرگتر، مانند کل کروموزوم ها، مناسب است. آخرین نتایج در سال 2017، تیم جهنم میکروسکوپ با وضوح فوق العاده MINFLUX را در علم گزارش کردند. به گفته Hell، این روش با وضوح فوق العاده برای اولین بار به وضوح فضایی 1 نانومتر دست می یابد. علاوه بر این، می تواند مولکول های منفرد در سلول های زنده را حداقل 100 برابر سریعتر از روش های دیگر ردیابی کند. دانشمندان دیگر نیز در مورد میکروسکوپ MINFLUX به شدت صحبت کردند. شختمن گفت: "برنامه ها و رویکردهای جدید دائما در حال توسعه هستند، اما دو پیشرفت برای من برجسته است." یکی MINFLUX است. از یک رویکرد هوشمندانه برای به دست آوردن موقعیت مولکولی بسیار دقیق استفاده می کند. در مورد دومین توسعه هیجان انگیز، شچمن به WE Moerner و همکارانش در دانشگاه استنفورد اشاره کرد. مورنر همچنین برنده جایزه نوبل شیمی در سال 2014 بود. یکی از برندگان. برای پرداختن به محدودیت وضوح تصویربرداری ناشی از پراکندگی ناهمسانگرد تک مولکول های فلورسنت، دانشمندان از قطبش های تحریکی مختلف برای تعیین جهت و موقعیت مولکول ها استفاده کردند. علاوه بر این، آنها سطوح مردمک ظریفی را ایجاد کرده اند. این تکنیک ها توانایی بومی سازی ساختارها را بهبود می بخشد. درباره برچسب های فلورسنت در بسیاری از برنامه های کاربردی با وضوح فوق العاده، برچسب ها واقعا اهمیت دارند. همچنین برخی از شرکت ها هستند که محصولات مرتبط را ارائه می دهند. به عنوان مثال، Miltenyi آلمان با Abberior، شرکتی که توسط Stefan Hell تأسیس شده است، برای ارائه خدمات ترکیب آنتی‌بادی سفارشی برای رنگ‌های میکروسکوپی با وضوح فوق‌العاده همکاری کرده است. تعدادی از شرکت های دیگر نیز نشانگرهای منطبق را ارائه می دهند. کریستوف اکرت، مسئول بازاریابی در ChromoTek می‌گوید: «نانو تقویت‌کننده‌های ما بسیار کوچک هستند، تنها ۱.۵ کیلو دالتون، و بسیار خاص هستند. این پروتئین ها به پروتئین های فلورسنت سبز و قرمز (GFP و RFP) متصل می شوند. آنها از قطعات آنتی بادی آلپاکا، معروف به VHH یا نانوبادی، با خواص اتصال عالی و کیفیت پایدار بدون تغییر دسته به دسته مشتق شده اند. این نشانگرها برای تکنیک های مختلف با وضوح فوق العاده از جمله SIM، PALM، STORM و STED مناسب هستند. Ai-Hui Tang، استادیار دانشکده پزشکی دانشگاه مریلند، و همکارانش از GFP-Booster و STORM ChromoTek برای کشف انتشار اطلاعات در سیستم عصبی استفاده کردند. آنها نانوخوشه های مولکولی به نام نانوستون را در نورون های پیش سیناپسی و پس سیناپسی پیدا کردند. دانشمندان بر این باورند که این ساختار نشان می دهد که سیستم عصبی مرکزی از اصول ساده ای برای حفظ و تنظیم کارایی سیناپسی استفاده می کند. نسخه‌های مختلف تصویربرداری با وضوح فوق‌العاده و تعداد فزاینده‌ای از روش‌ها، دانشمندان را حتی بیشتر به اسرار بیولوژیکی می‌برد. با شکستن حد پراش نور مرئی، زیست‌شناسان حتی می‌توانند عملکرد سلول‌ها را از نزدیک تحت نظر بگیرند.
